| 查看: 6699 | 回复: 6 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[求助]
镍柱亲和层析纯化
|
||||
| 求助各位高手，我做的是真核细胞内纯化his标签蛋白，做镍柱亲和层析时在流穿的部分也检测到目的蛋白了，我的裂解液里含10mM咪唑，请大家帮我分析一下原因 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白质生物学实验经验 | 结构生物学 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有238人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 亲和镍柱那个公司的好？
已经有6人回复
- 毕赤酵母表达蛋白纯化
已经有10人回复
- 怎样能得到高纯度的蛋白？
已经有10人回复
- His Tag融合蛋白纯化
已经有8人回复
- 组氨酸标签的问题
已经有27人回复
- His标签的蛋白纯化柱子
已经有10人回复
- 亲和层析柱重生问题
已经有8人回复
- 关于GST亲和层析的几点疑惑？
已经有5人回复
- 关于his-tag蛋白的分离和纯化 微生物产生！文献多多益善
已经有10人回复
- 融合蛋白不挂柱，急！
已经有7人回复
- 进行羟胺裂解后，进行蛋白的二次过亲和层析住纯化问题！！！！求助啊 ！！！
已经有9人回复
- Tris-Hcl缓冲液
已经有8人回复
- 【求助/交流】胰蛋白酶抑制剂琼脂糖凝胶 PTI 亲和层析柱的应用
已经有4人回复
- 【求助/交流】Ni柱洗脱蛋白
已经有6人回复
- 【分享】蛋白质纯化个人总结2
已经有38人回复
- 包涵体变性复性
已经有11人回复
3楼2013-11-08 16:39:15
susizheng
木虫 (著名写手)
我們是糖 甜到憂傷
- MolEPI: 10
- 应助: 130 (高中生)
- 贵宾: 0.008
- 金币: 4706.8
- 散金: 2273
- 红花: 56
- 帖子: 2319
- 在线: 742.9小时
- 虫号: 642666
- 注册: 2008-11-01
- 性别: GG
- 专业: 有机合成
2楼2013-11-08 15:16:56
susizheng
木虫 (著名写手)
我們是糖 甜到憂傷
- MolEPI: 10
- 应助: 130 (高中生)
- 贵宾: 0.008
- 金币: 4706.8
- 散金: 2273
- 红花: 56
- 帖子: 2319
- 在线: 742.9小时
- 虫号: 642666
- 注册: 2008-11-01
- 性别: GG
- 专业: 有机合成
4楼2013-11-08 17:13:23
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2119.9
- 散金: 10
- 红花: 209
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 丽丽好人！ 2013-11-18 17:25:55
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 丽丽好人！ 2013-11-18 17:25:55
|
楼主的问题就是带组氨酸X6标签的蛋白质挂上镍柱能力差的问题，我提示几点： 1.目的蛋白质如果在表达过程中一直处于溶解状态的，在非变性条件下也能够和Ni-NTA柱上得到纯化。如果形成了包涵体过着其他不溶性沉淀，可在6mol/L的盐酸胍或者8mol/LUrea中溶解后上镍柱。对于分泌蛋白质一般采用非变性条件纯化。变性过程可以用表面活性剂。 2.纯化时可采用变性条件和非变性条件，取决于目标蛋白质的溶解度和（His）6是否能够暴露在蛋白质的分子表面。如果在变性条件或者非变性条件下之一不挂柱，可改换位另一条件，并且改用别的变性剂或者表面活性剂。 大于1mmol/L的DTT会还原镍离子而无法挂柱。 3.如果溶液中存在较高浓度的螯合剂（EDTA/ETGA等）、离子型去污剂、甘氨酸、组胺、含有NH4+离子的试剂等，都会使得目的蛋白质无法挂上镍柱。 4.蛋白质形成了多聚体、或者与DNA相互作用遮蔽了（His）6位点也会使得目的蛋白质无法挂上镍柱。 5.目的蛋白质折叠时形成了遮蔽了（His）6位点会使得目的蛋白质无法挂上镍柱，构建基因时（His）6可以在N末端也可以在C末端，但是要处于蛋白质的分子表面，而且要与蛋白质分子之间最好有一段亲水序列，最好能够引入酶切位点（比如凝血酶酶切位点）。 6.可能在楼主的实验条件下，被纯化的蛋白质发生了聚合，也就是遮盖了至少一些蛋白质分子上的组氨酸X6标签的，洗脱时实际上先被洗下来的不是结合在镍柱上靠组氨酸X6标签与镍离子形成配位键的目的蛋白质，而是结合在镍柱上靠组氨酸X6标签与镍离子形成配位键的目的蛋白质以非共价建附着的目的蛋白质。 |
5楼2013-11-09 02:29:23
28