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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 亲和层析柱重生问题
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zhougama

禁虫 (正式写手)
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Ni柱再生方法

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1楼 2012-06-05 21:23:44
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+8, BioEPI+1, 应助指数+1, 鼓励发帖交流 2012-06-06 15:10:24
你的问题我们以前也讨论过。
就是咪唑能洗下蛋白，buffer能洗下咪唑，但是buffer不能洗下蛋白的问题。
要记住一点，这理论是完全没有问题的。所以柱子并不是每次都要重生。至于为什么这样，我问过我们这边的一个负责人，他说这是各种结合方式和作用力不同的结果。
要明白，免疫亲和机理导致互相结合，不是一种力的作用结果，是多种力共同作用的，可能会存在范德华力，氢键之类的。分析一种结合方式和另外一种结合方式之间谁强谁弱，是要看起主导作用的力的大小。
大家都知道，蛋白上标签和金属Ni以免疫亲和机理结合，而咪唑的咪唑环与金属Ni的结合能力比HIS标签结合能力强，但是他们作用力不一样。具体我不知道是什么力，我不能乱说。就比如说，后者氢键结合能力比前者范德华力结合能力强所以前者就被挤下来了，但是，buffer的其他的作用力比咪唑强，就能洗下咪唑，但是buffer的综合作用力比不上蛋白的结合能力，所以没法被洗脱。
我知道的大概就这么多，希望你能理解我的意思。
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6楼2012-06-06 14:50:46
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhougama: 金币+5, ★有帮助 2012-06-07 08:41:43
本帖内容被屏蔽
2楼2012-06-06 08:51:48
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danbomingyue

禁虫 (正式写手)
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3楼2012-06-06 08:52:35
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ghost202

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+2, 谢谢参与 2012-06-06 15:11:08
zhougama: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-06-07 08:41:26
这个问题很简单的，不需要将咪唑完全洗下来。只需要下次用的时候用binding buffer平衡一下就可以了。你要明确蛋白纯化的原理，当咪唑浓度低的时候，蛋白的竞争能力是会比咪唑强的。
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4楼2012-06-06 11:54:22
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冰冰逛论坛

新虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
qinhy: 应助指数-1 2012-06-06 15:07:07
岁月悠悠，织出我们真诚的友谊，寒窗几载，谱出我们欢乐的乐章。
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5楼2012-06-06 12:44:18
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8638600

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhougama: 金币+5, ★有帮助, 是竞争洗脱的 2012-06-07 08:42:01
会不会是因为高浓度的咪唑使得蛋白溶于咪唑溶液，而非竞争性的取代蛋白与柱子结合？所以只需要用buffer冲洗就ok了~
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7楼2012-06-06 15:05:29
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wintersand

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhougama: 金币+15, ★★★很有帮助, 非常感谢你的回答，受益匪浅！ 2012-06-08 19:29:11
不需要每次都重生柱子，可以用一段时间以后再重生。如果担心柱子不干净，可以每次用0.1M的氢氧化钠或者含有500mM咪唑的8M尿素洗两个柱体积就好了，不过洗完后一定要用水冲干净，不然下次用的时候蛋白就变性了。
至于蛋白和咪唑同Ni离子的亲和力问题我是这样认为的，蛋白上具有6个咪唑基团能与Ni 离子结合，因此会比单个的咪唑分子结合得更强，buffer洗不下来蛋白却能洗下咪唑；而咪唑能把蛋白竞争下来是靠浓度来实现的，只有较高浓度的咪唑才能把Ni离子全部抢过来。
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8楼2012-06-08 11:31:49
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爱音乐之

新虫 (初入文坛)
想问一下，你们使用的Buffer是什么呀？？？我不清楚这里的Buffer或者其他人提到的Binding Buffer 是什么……
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9楼2013-05-21 16:47:58
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