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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 镍柱亲和层析纯化
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gengpy470

新虫 (小有名气)

[求助] 镍柱亲和层析纯化

求助各位高手，我做的是真核细胞内纯化his标签蛋白，做镍柱亲和层析时在流穿的部分也检测到目的蛋白了，我的裂解液里含10mM咪唑，请大家帮我分析一下原因
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1楼2013-11-08 10:20:33
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swani

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

如果是包涵体的话，那么上柱的样品应该是很混的，而且上柱前lz肯定是离心过的，包涵体比重大很容易去除，所以lz的情况肯定不是因为目的蛋白形成了包涵体的原因。

镍柱的柱容量不大，而且特异性不是我们想象的那么好，真核细胞破碎后含有的蛋白种类太多，lz的情况极有可能是蛋白过载而流穿，建议减少上样量或者加大柱体积，或者换种填料先做一次初纯化。当然，希望lz的镍柱本身是没有问题的。
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7楼2013-11-19 05:23:59
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-18 17:25:26
10mM咪唑就将目的蛋白洗脱了？
有可能真核蛋白各种修饰和折叠较多，将his标签包埋在内部了。
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Thank-you，so-blue.
2楼2013-11-08 15:16:56
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gengpy470

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by susizheng at 2013-11-08 15:16:56
10mM咪唑就将目的蛋白洗脱了？
有可能真核蛋白各种修饰和折叠较多，将his标签包埋在内部了。

那我要是加变性剂脲的话，在裂解液，漂洗液，和洗脱液里都需要加吗，我认为在洗脱液里不需要加了吧
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3楼2013-11-08 16:39:15
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
不用吧，只需要在变性的时候加变形剂吧。
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Thank-you，so-blue.
4楼2013-11-08 17:13:23
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