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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 实验讨论 » 一步PCR 定点突变
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zjl0106

铜虫 (小有名气)

[求助] 一步PCR 定点突变

最近在做一个突变，目的片段1000，连在一个4000多的载体上。想先用突变引物将整个质粒扩出来，然后用DpnI处理模板。但是经过多次PCR 均没有扩出质粒。想请问一下做过一步定点突变的朋友，在设计引物及反应体系方面的经验，谢谢！
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1楼 2013-10-23 21:00:24
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爱的天使13

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
zjl0106(liusir3836代发): 金币+2, 代楼主发金币2枚以表鼓励，感谢对本版的贡献！ 2014-03-12 13:04:21
PCR时换一下酶，如phution
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2楼2013-11-30 10:29:39
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狮子山下君

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
zjl0106(liusir3836代发): 金币+1, 代楼主发金币1枚以表鼓励，感谢对本版的贡献！ 2014-03-12 13:04:32
我也在做点突变，1700多的片段，2980的载体，也是想要用突变引物讲整个质粒扩出来，但是已经扩了两个多月了，就只突变了一个位点。可以问一下你是用什么扩的，我用的是premierstar扩的。谢谢！！
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3楼2013-12-20 09:30:14
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
zjl0106(liusir3836代发): 金币+1, 代楼主发金币1枚以表鼓励，感谢对本版的贡献！ 2014-03-12 13:04:42
你的引物应该设计长一点，40bp，前20bp用来扩增，后20bp用来重组，我就做这个，可以交流。
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4楼2014-01-02 15:08:18
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zjl0106

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 狮子山下君 at 2013-12-20 09:30:14
我也在做点突变，1700多的片段，2980的载体，也是想要用突变引物讲整个质粒扩出来，但是已经扩了两个多月了，就只突变了一个位点。可以问一下你是用什么扩的，我用的是premierstar扩的。谢谢！！

我是用phanta 扩的，加了随酶带有的enhancer。你可以试试。20ul体系，从55-65度，2度一个梯度。
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5楼2014-01-09 20:19:01
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狮子山下君

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zjl0106 at 2014-01-09 20:19:01
我是用phanta 扩的，加了随酶带有的enhancer。你可以试试。20ul体系，从55-65度，2度一个梯度。...

谢谢，我的在上个星期扩出来了，是我的引物出现了错误。经过更换引物，这次扩就出来了。PCR产物经回收，用Dpn1酶处理了3.5h，20ul的体系。转化，长出的菌落不多就20几个，我随机的挑了四个菌落，提质粒，送去测学都发生了突变。
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6楼2014-01-13 15:03:07
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