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zjl0106

铜虫 (小有名气)

[求助] 一步PCR 定点突变

最近在做一个突变,目的片段1000,连在一个4000多的载体上。想先用突变引物将整个质粒扩出来,然后用DpnI处理模板。但是经过多次PCR 均没有扩出质粒。想请问一下做过一步定点突变的朋友,在设计引物及反应体系方面的经验,谢谢!
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爱的天使13

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
zjl0106(liusir3836代发): 金币+2, 代楼主发金币2枚以表鼓励,感谢对本版的贡献! 2014-03-12 13:04:21
PCR时换一下酶,如phution
2楼2013-11-30 10:29:39
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狮子山下君

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


zjl0106(liusir3836代发): 金币+1, 代楼主发金币1枚以表鼓励,感谢对本版的贡献! 2014-03-12 13:04:32
我也在做点突变,1700多的片段,2980的载体,也是想要用突变引物讲整个质粒扩出来,但是已经扩了两个多月了,就只突变了一个位点。可以问一下你是用什么扩的,我用的是premierstar扩的。谢谢!!
3楼2013-12-20 09:30:14
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


zjl0106(liusir3836代发): 金币+1, 代楼主发金币1枚以表鼓励,感谢对本版的贡献! 2014-03-12 13:04:42
你的引物应该设计长一点,40bp,前20bp用来扩增,后20bp用来重组,我就做这个,可以交流。
4楼2014-01-02 15:08:18
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zjl0106

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 狮子山下君 at 2013-12-20 09:30:14
我也在做点突变,1700多的片段,2980的载体,也是想要用突变引物讲整个质粒扩出来,但是已经扩了两个多月了,就只突变了一个位点。可以问一下你是用什么扩的,我用的是premierstar扩的。谢谢!!

我是用phanta 扩的,加了随酶带有的enhancer。你可以试试。20ul体系,从55-65度,2度一个梯度。
5楼2014-01-09 20:19:01
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狮子山下君

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zjl0106 at 2014-01-09 20:19:01
我是用phanta 扩的,加了随酶带有的enhancer。你可以试试。20ul体系,从55-65度,2度一个梯度。...

谢谢,我的在上个星期扩出来了,是我的引物出现了错误。经过更换引物,这次扩就出来了。PCR产物经回收,用Dpn1酶处理了3.5h,20ul的体系。转化,长出的菌落不多就20几个,我随机的挑了四个菌落,提质粒,送去测学都发生了突变。
6楼2014-01-13 15:03:07
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