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一苇杭之xmc

银虫 (初入文坛)

[求助] 急~~~！！！sds-page电泳，重复了n次，都是这种死样子！已有1人参与

一跑就散了，而且各泳道都扩散到一起去了！！！而且整个过程中都跑的不整齐，不是一条线的那种。我这次特地把maker点在中间了，是不是真的是我样品问题啊，而且感觉跑的比较快。已经重复n次了，累死不说，心都哇凉哇凉的，求各位大神帮助啊~！
我提蛋白用的成分是7M尿素 2M硫脲 2% tritonx-100 蛋白酶抑制剂 50mM DTT
提取之后我稀释定量，基本上都在2g/L左右的。然后直接上样。求大神指教如何处理样品，求~~~
急~~~！！！sds-page电泳，重复了n次，都是这种死样子！
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急~~~！！！sds-page电泳，重复了n次，都是这种死样子！-1
DSC_0633.jpg

[ Last edited by 一苇杭之xmc on 2013-10-22 at 16:30 ]
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欲速则不达
1楼2013-10-22 16:27:40
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-23 10:39:55
gyesang: 金币+5, 欢迎老版主常来！ 2013-10-24 12:24:18
gyesang: 回帖置顶 2013-10-24 12:24:21
给你个SDS-PAGE“耻辱堂”，自己对照下看看吧
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html
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4楼2013-10-22 20:35:58
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woai43

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-10-23 08:34:20
应该是尿素和硫脲的问题，我之前用尿素纯化his标签蛋白sds-page就跟你这个差不多。Maker是被两侧蛋白挤到了所以上面宽下面窄。你可以尝试把样品透析降低尿素试试看
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7楼2013-10-23 08:12:01
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zhixuec

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

尿素和硫脲的确会影响你的电泳的

我们一般用了尿素和硫脲后将样品透析除去这两张物质，再SDS-PAGE的
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酷爱の族
10楼2014-01-21 11:36:55
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普通回帖

同东中郎将

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-10-22 18:26:21
1，检测一下你的电泳槽是否漏液。
2，每个样品间间隔一个空白，试一下。
3，你的上样量是多少？感觉样品没多少蛋白。
4，脱色脱的时间短，看不清。
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曾子曰：“士不可以不弘毅，任重而道远。仁以为己任，不亦重乎？死而后已，不亦远乎？”
2楼2013-10-22 17:14:02
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一苇杭之xmc

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 同东中郎将 at 2013-10-22 17:14:02
1，检测一下你的电泳槽是否漏液。
2，每个样品间间隔一个空白，试一下。
3，你的上样量是多少？感觉样品没多少蛋白。
4，脱色脱的时间短，看不清。

电泳槽漏液的话是不是装的时候没装紧啊~我用bradford法定量出来的浓度有1~2g/L左右，上样量是25微升。其实我试过好几次了，每次提取样品都跑出来是这样，各个泳道都连到一起了。。。marker跑的都没什么问题，脱色是我今天实在是太沮丧了，脱到这样懒得往下做了。
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欲速则不达
3楼2013-10-22 17:32:32
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西瓜 at 2013-10-22 20:35:58
给你个SDS-PAGE“耻辱堂”，自己对照下看看吧
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/sdsgoofs.html

特此过来顶大哥的贴~
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Let God do with it as He wills
5楼2013-10-22 21:28:00
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storm26

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-10-23 08:33:59
本帖内容被屏蔽
6楼2013-10-22 21:38:32
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-24 12:25:10
SDS电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(2013-10-7)

1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100µL。
2.原因二：样品溶解不完全。
对策：
（1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。不要把Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开），而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
（3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS 用量要充分。

SDS电泳带变宽的原因和改进措施(2013-10-7)
除了以上两条原因外，还有：
原因三：SDS电泳带与邻近蛋白质电泳相连。除了上样量过多和样品溶解不完全外，凝胶的加样孔泄露会使得电泳带变宽。加样孔泄露往往由于凝胶与玻璃板之间产生裂纹引起。对策：此时只能重新制备凝胶，梳子拔起时要小心等凝胶凝聚完毕，速度不宜过快，拔起的方向要垂直于凝胶表面；要避免凝胶两侧的玻璃板与凝胶之间产生裂纹，在凝胶制备过程中不要挤压凝胶两侧的玻璃板。
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8楼2013-10-23 11:23:31
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-24 12:25:01
SDS-PAGE electrophoresis的蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散的原因和解决方法

2013年10月24日

蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散可能有多种原因。
1.加样量过多，会引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。为了提高分辨率，应该避免加样过多，小体积样品可给出窄带.加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100µL。
2.加样没有立即电泳会引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。加热蛋白质样品变性需要沸水浴3-5分钟即可，加热变性后的蛋白质样品要放置到室温即电泳，不要久放，因为蛋白质的二硫键在高温下可能是会断开，但是暴露于空气中温度降低会重新形成二硫键，而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠，更不要扔到冰箱里保存。
3.电泳凝胶浓度选择不适当引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。请根据厂商的说明书配制对应蛋白质相对分子量的适当浓度的电泳凝胶，使得蛋白质组分的以充分分离。
4.通常靠近前沿的电泳带分辨率不佳。应根据分子量与凝胶孔径的关系，灌制适当浓度的凝胶。
5.蛋白质样品被水解。注意除去蛋白质样品的内源性的水解酶，不要反复冻融。
6.电泳时间过长或过短。溴酚蓝达到分离胶的底部即应该关闭电泳电源。
7.低于10Kd的蛋白质分子在SDS-PAGE electrophoresis不可能获得好的分辨率，此时要用Tricine胶。
8.缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。
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9楼2013-10-24 01:24:55
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