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一苇杭之xmc

银虫 (初入文坛)

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[求助] 急~~~！！！sds-page电泳，重复了n次，都是这种死样子！已有1人参与

一跑就散了，而且各泳道都扩散到一起去了！！！而且整个过程中都跑的不整齐，不是一条线的那种。我这次特地把maker点在中间了，是不是真的是我样品问题啊，而且感觉跑的比较快。已经重复n次了，累死不说，心都哇凉哇凉的，求各位大神帮助啊~！
我提蛋白用的成分是7M尿素 2M硫脲 2% tritonx-100 蛋白酶抑制剂 50mM DTT
提取之后我稀释定量，基本上都在2g/L左右的。然后直接上样。求大神指教如何处理样品，求~~~

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[ Last edited by 一苇杭之xmc on 2013-10-22 at 16:30 ]

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欲速则不达

1楼2013-10-22 16:27:40

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凌波丽

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【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-24 12:25:01

SDS-PAGE electrophoresis的蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散的原因和解决方法

2013年10月24日

蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散可能有多种原因。
1.加样量过多，会引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。为了提高分辨率，应该避免加样过多，小体积样品可给出窄带.加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100µL。
2.加样没有立即电泳会引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。加热蛋白质样品变性需要沸水浴3-5分钟即可，加热变性后的蛋白质样品要放置到室温即电泳，不要久放，因为蛋白质的二硫键在高温下可能是会断开，但是暴露于空气中温度降低会重新形成二硫键，而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠，更不要扔到冰箱里保存。
3.电泳凝胶浓度选择不适当引起蛋白质条带模糊、分辨不佳和条带扩散。请根据厂商的说明书配制对应蛋白质相对分子量的适当浓度的电泳凝胶，使得蛋白质组分的以充分分离。
4.通常靠近前沿的电泳带分辨率不佳。应根据分子量与凝胶孔径的关系，灌制适当浓度的凝胶。
5.蛋白质样品被水解。注意除去蛋白质样品的内源性的水解酶，不要反复冻融。
6.电泳时间过长或过短。溴酚蓝达到分离胶的底部即应该关闭电泳电源。
7.低于10Kd的蛋白质分子在SDS-PAGE electrophoresis不可能获得好的分辨率，此时要用Tricine胶。
8.缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。