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一苇杭之xmc

银虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
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虫号: 1804835
注册: 2012-05-09
性别: MM
专业: 环境工程

[求助] 急~~~！！！sds-page电泳，重复了n次，都是这种死样子！已有1人参与

一跑就散了，而且各泳道都扩散到一起去了！！！而且整个过程中都跑的不整齐，不是一条线的那种。我这次特地把maker点在中间了，是不是真的是我样品问题啊，而且感觉跑的比较快。已经重复n次了，累死不说，心都哇凉哇凉的，求各位大神帮助啊~！
我提蛋白用的成分是7M尿素 2M硫脲 2% tritonx-100 蛋白酶抑制剂 50mM DTT
提取之后我稀释定量，基本上都在2g/L左右的。然后直接上样。求大神指教如何处理样品，求~~~

DSC_0634.jpg

DSC_0633.jpg

[ Last edited by 一苇杭之xmc on 2013-10-22 at 16:30 ]

回复此楼

欲速则不达

1楼2013-10-22 16:27:40

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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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管辖: 生物科学综合

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-24 12:25:10

SDS电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(2013-10-7)

1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15µL（即2-10µg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100µL。
2.原因二：样品溶解不完全。
对策：
（1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。不要把Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开），而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
（3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS 用量要充分。

SDS电泳带变宽的原因和改进措施(2013-10-7)
除了以上两条原因外，还有：
原因三：SDS电泳带与邻近蛋白质电泳相连。除了上样量过多和样品溶解不完全外，凝胶的加样孔泄露会使得电泳带变宽。加样孔泄露往往由于凝胶与玻璃板之间产生裂纹引起。对策：此时只能重新制备凝胶，梳子拔起时要小心等凝胶凝聚完毕，速度不宜过快，拔起的方向要垂直于凝胶表面；要避免凝胶两侧的玻璃板与凝胶之间产生裂纹，在凝胶制备过程中不要挤压凝胶两侧的玻璃板。