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LWL8798

新虫 (初入文坛)

[求助] overlap PCR

我最近在做overlap PCR,前后两段都已经P出来了,现在做连接,用了touchdown,温度从65℃降到45℃,但是依然没有条带,真不知道是什么出来问题,如果异物有问题,那前后两段也不能P出来吧!
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dkyy970111

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-10-21 17:58:16
重叠区多长?退火应该是逐渐增高的,试下45度,5 cycles,再65度 25cycles
打铁还要自身硬
3楼2013-10-21 16:40:00
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niil

金虫 (正式写手)

有详细的实验步骤么?
Stop fighting,let it flow.
2楼2013-10-21 16:25:15
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LWL8798

新虫 (初入文坛)

我是因为我想要的那段有个突变,想改过来,所以用了这个,直接设计了两个完全互补的引物,重叠区有31个碱基,PCR的程序是98℃变性5min,98℃30s,65℃-45℃touchdown,然后72℃2min,后用50℃的退火温度,40个循环都没有条带。
4楼2013-10-21 16:51:25
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LWL8798

新虫 (初入文坛)

我把最初的两条带重新P了一下,现在有结果了。
5楼2013-10-21 20:49:26
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