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LWL8798

新虫 (初入文坛)

[求助] overlap PCR

我最近在做overlap PCR，前后两段都已经P出来了，现在做连接，用了touchdown，温度从65℃降到45℃，但是依然没有条带，真不知道是什么出来问题，如果异物有问题，那前后两段也不能P出来吧！
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1楼 2013-10-21 16:14:39
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niil

金虫 (正式写手)
有详细的实验步骤么？
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Stop fighting,let it flow.
2楼2013-10-21 16:25:15
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dkyy970111

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-10-21 17:58:16
重叠区多长？退火应该是逐渐增高的，试下45度，5 cycles，再65度 25cycles
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打铁还要自身硬
3楼2013-10-21 16:40:00
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LWL8798

新虫 (初入文坛)
我是因为我想要的那段有个突变，想改过来，所以用了这个，直接设计了两个完全互补的引物，重叠区有31个碱基，PCR的程序是98℃变性5min，98℃30s，65℃-45℃touchdown，然后72℃2min，后用50℃的退火温度，40个循环都没有条带。
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4楼2013-10-21 16:51:25
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LWL8798

新虫 (初入文坛)
我把最初的两条带重新P了一下，现在有结果了。
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5楼2013-10-21 20:49:26
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王者归来001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-29 18:28:31
序列重复片段长多多少？我之前也做过，融合不上的时候可以换换酶，也可以用touchdown的方法
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坚持不懈,终会成功!
6楼2013-10-22 16:56:19
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