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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 请教如何进行多肽与蛋白结合的过程中，多肽上关键氨基酸的预测？
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小雨莎莎

木虫 (正式写手)

[求助] 请教如何进行多肽与蛋白结合的过程中，多肽上关键氨基酸的预测？

请教一下各位虫友，不知道有没有做过蛋白或者多肽结构运算或者是预测的，我现在筛选到一条多肽，只有十来个氨基酸，完全是随机序列，没有ｃｙｓ来固定一个闭合环。这个多肽能够与一个特定的靶蛋白结合，然后我想做改造，希望能优化它与靶点的结合情况比如说想增强亲和力，想提高其生理功能，考虑想要预测一下或者计算模拟一下在这十五个氨基酸中，哪些氨基酸是对结合有很重要的作用的，请问该怎么做呢？有没有什么软件，还是说需要通过做生物信息学研究的老师帮忙才能做出来？谢谢！
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1楼 2013-09-04 16:49:06
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

共结晶还是不要做了吧！单独结晶一种蛋白质都和不容易，别说共结晶了。
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15楼2013-09-08 17:16:47
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小雨莎莎: 金币+10, ★★★很有帮助, 3Q！ 2013-09-08 17:32:50
当然是有软件可以模拟蛋白质-多肽、蛋白质-蛋白质相互之作用的；还以用交联剂把彼此接触的蛋白质-蛋白质、蛋白质-多肽之间形成共价连接，然后分析结构结合的序列；另外用冷冻电镜也可以研究蛋白质-多肽、蛋白质-蛋白质相互之作用的具体的精细结构；NMR当然也可以解析蛋白质-多肽、蛋白质-蛋白质相互之作用的具体的精细结构，但是先要用自旋量子数不为零的原子同位素标记，要从上游开始，况且分子量大于40KD基本上现在就能没戏了，所以还是算了吧；还可以用单分子生物学实验技术。。。

方法无论是模拟方法还试验方法都有很多，模拟出来也要用实验进行检测。我们可以具体讨论，但是今天我没有时间了，晚上有安排，而且也不是一两句话能够说清楚的，改日在讨论吧。
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16楼2013-09-08 17:25:58
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

今天需要我晚上6点到达的邀请包括我在内的十数人的饭局正式开始前，对于楼主的实验的全流程，我实际上已经想出来了。不过细节比较众多，所以改日我再再和你具体讨论了，可能还要贴一些实验手册（英文版）。
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17楼2013-09-08 23:44:07
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小雨莎莎: 金币+10, ★★★很有帮助, 3Q 2013-09-09 13:38:47
我就先提示楼主几点：
1.如何将多肽与其非共价的相互作用的蛋白质共价相连接？然后如何去掉多余的肽段？再如何把多余的肽段的序列测出来？
2.如果不知道蛋白质的全序列，有什么办法知道去全序列，用MS-MS测序-------估计有钱太多都不知道该怎么花了！------那有什么其他办法？用ediman降解法的自动测序仪当然是一种办法，还有更省事的办法吗？
3.多肽与其非共价的相互作用的蛋白质共价相连接后，我们怎么能够知道大致的位点，以便去除多余的部分？--------这部做好了，可以省很多钱的。
4.用分子对接软件预测多肽与其非共价的相互作用的蛋白质的结合位点行不行？
5.多肽与其非共价的相互作用的蛋白质共价相连接的Bioconjugate方法有哪些选择？考虑一下如何针对不同的氨基酸侧链？如果引起蛋白质分子表面的分布丰富的氨基酸的修饰，如何避免"杂音"-------或者去掉杂音或者创建同种的本底信息，在比对中去掉？
侧链
6.不要总是琢磨从上游动手，光是构建基因就够忙一阵的，也不嫌累！---------能够直接从多肽和蛋白质本身动手就不要从基因表达水平动手。NMR看来玩不起，那么就没有别的办法可以解析复合物的空间结构了？共结晶就算了。
7.能不能考虑单分子成像技术？
8.不要只用单一技术，而应该综合使用研究技术，多角度考虑。先进的技术要用，不先进的但是有效的研究技术巧妙的使用，可能也会有意想不到的收获。
9.设想1-5在不知道蛋白质的空间结构的情况下能够实现吗？
10.不知道蛋白质的空间结构的情况，能不能预测其空间结构（模拟）？可以用那些软件？这样的模拟对于你的实验具体有哪些价值？
我就先说这些，实际上我已经说了一些实验流程的ideas.
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小雨莎莎
18楼2013-09-09 00:07:11
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
你的实验的预测与模拟部分我查出了很多方法，不用花钱，用网上数据库和预测软件就可以实现，比我远想的要简单很多。但是楼主课题的实验部分，我还要确定很多细节，所以大概下周我才能完整的回复楼主完整的试验流程（预测与模拟+实验检测）。
在这里我可以明确地告诉楼主：仅仅根据预测与模拟分子结合位点的数据是不可能被承认的，必须要有试验检测。但是要是如楼主所言用点突变蛋白质的被预测的接触残基后，再用噬菌体展示或者其他任何实验方法用点突变蛋白质的被预测的接触残基的蛋白质与多肽的结合情况，得出的蛋白质-多肽的结合位点的结论会被群起而攻之！
因为用点突变蛋白质的被预测的接触残基后，蛋白质的折叠状态可能会改变，尤其是从头表达时更是如此。。。先说这些了。你得等等吧。
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20楼2013-09-09 16:56:17
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

点突变多肽是一般可行的，突变掉多肽后对于多肽-蛋白质的相互作用的检测并不能指示出蛋白质分子表面的多肽-蛋白质的相互作用的具体位点，只能指示出多肽上的与蛋白质的相互作用的具体位点。

试验检测多肽-蛋白质的相互作用或者蛋白质-蛋白质的相互作用的方法很多，如果让我做，我不会使用噬菌体展示检测，而会使用更省事的一组试验方法，点突变后的多肽-蛋白质的相互作用的检测，我也不会用噬菌体展示检测；对于蛋白质点突变而后，用实验方法多肽-蛋白质的相互作用，出于更加严谨的试验流程，可以在最后一步执行，不过不使用噬菌体展示检测，太麻烦。

你的课题用不着分子对接软件，具体材料（包括预测+试验检测）我昨天已经把草稿写完了，今天交到文印室去录入，我自己没有时间录入，内容比较多，录入完我会修改补充，下周正回复你这贴。以上问题我会在正式回复中提出自己的protocols,现在不回答是因为我考虑可能会有更好的protocols。
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22楼2013-09-10 08:29:24
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
小雨莎莎: 金币+6, ★★★很有帮助, 谢谢！就剩这些金币啦~全送啦~3Q 2013-09-22 10:26:57
配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的序列的确定
总体思路与研究方法：
用免费软件或者从免费数据库获得配体多肽-受体蛋白质的可能的相互作用的位点的序列信息。
不要使用分子对接软件（无论是否是免费）预测配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的序列，现在分子对接软件对于 配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的序列的确定精度不够，而且也没有必要。配体多肽在数据库没有ID，是否可能从免费数据库预测到近似的配体多肽-受体蛋白质的可能的相互作用的位点的序列信息。
直接利用数据库的已有信息即可做出有效的预测。
无论有如何精确的预测也必须要用实验检测才会被承认。
配体多肽、受体蛋白质的二级和三级结构预测的软件；配体多肽、受体蛋白质的二级和三级结构预测对于后续工作的价值。
如果不知道受体蛋白质的全序列，可以用哪些方法快速获得。从头测序是最后的不得已的手段。
配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的用共价交联加以固定化。
配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的共价交联加以固定化实质上是受体-配体的一种共价交联。
配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的共价交联的交联剂的选择及其理由。
配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的共价交联的交联是否是只限于配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点之间，如果不是，如何加以避免和区别。
配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的共价交联成功的高通量检测方法（质谱、光谱、分子筛层析、非变性凝胶电泳等），最好是不损失检测样品。
被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列分离和纯化。
有限水解片段蛋白质，
被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列分离和纯化，分子筛层析、非变性凝胶电泳等。
(3)尽量减少被共价交联固定化的双股多肽片段的游离单肽链部分。
共价交联方法加以固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列分离和纯化的序列测定。
串联质谱方法(MS-MS)鉴定和搜索多肽序列的原理。
串联质谱方法(MS-MS)从头测定多肽序列的原理。
串联质谱方法(MS-MS)检测蛋白质翻译后加工的原理与举例分析。
Edman 降解反应在多肽测序时遇到修饰氨基酸的具体反映。会不会终止反应？会不会一定不终止反应？如果不终止反应对于测定具体的修饰氨基酸的位点是否有帮助。
非质谱方法测定蛋白质翻译后加工。
被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列的串联质谱方法(MS-MS)从头测序。
被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列的非串联质谱方法(MS-MS)的从头测序。
被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列的扣除法推定测序。
被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列确定是否需要重新解开交联，如果必须如此是否可行，应该如何选择交联剂。
分支状肽链的结构的质谱与非质谱确定方法。
肽链的分支状共价修饰结构的质谱与非质谱确定方法。
配体多肽-受体蛋白质的可能的相互作用的位点的序列确定后，用点突变的方法加以验证，并且用实验方法检测和比较突变前后的配体多肽与受体蛋白质相互作用的结合力的数值的变化。
     以上每一条都具体的对应的内容（包括研究实例），没有留下空白的标题。

因为内容很多，我先把提纲回答给你，然后会把提纲填充上具体的内容。时间不会很长。
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31楼2013-09-19 11:14:18
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
就研究多肽-蛋白质相互作用而言，确定彼此的相互作用的具体作为序列还是有价值的。
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32楼2013-09-19 11:17:25
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的序列的确定
总体思路与研究方法：
1用免费软件或者从免费数据库获得配体多肽-受体蛋白质的可能的相互作用的位点的序列信息。
（1）不要使用分子对接软件（无论是否是免费）预测配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的序列，现在分子对接软件对于 配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的序列的确定精度不够，而且也没有必要。配体多肽在数据库没有ID，是否可能从免费数据库预测到近似的配体多肽-受体蛋白质的可能的相互作用的位点的序列信息。
（2）直接利用数据库的已有信息即可做出有效的预测。
（3）无论有如何精确的预测也必须要用实验检测才会被承认。
（4）配体多肽、受体蛋白质的二级和三级结构预测的软件；配体多肽、受体蛋白质的二级和三级结构预测对于后续工作的价值。
（5）如果不知道受体蛋白质的全序列，可以用哪些方法快速获得。从头测序是最后的不得已的手段。
2.配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的用共价交联加以固定化。
（1）配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的共价交联加以固定化实质上是受体-配体的一种共价交联。
（2）配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的共价交联的交联剂的选择及其理由。
（3）配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的共价交联的交联是否是只限于配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点之间，如果不是，如何加以避免和区别。
（4）配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的共价交联成功的高通量检测方法（质谱、光谱、分子筛层析、非变性凝胶电泳等），最好是不损失检测样品。
3.被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列分离和纯化。
（1）有限水解片段蛋白质，
（2）被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列分离和纯化，分子筛层析、非变性凝胶电泳等。
（3）尽量减少被共价交联固定化的双股多肽片段的游离单肽链部分。
4.共价交联方法加以固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列分离和纯化后的序列测定。
（1）串联质谱方法(MS-MS)鉴定和搜索多肽序列的原理。
（2）串联质谱方法(MS-MS)从头测定多肽序列的原理。
（3）串联质谱方法(MS-MS)检测蛋白质翻译后加工的原理与举例分析。
（4）Edman 降解反应在多肽测序时遇到修饰氨基酸的具体反映。会不会终止反应？会不会一定不终止反应？如果不终止反应对于测定具体的修饰氨基酸的位点是否有帮助。
（5）非质谱方法测定蛋白质翻译后加工。
（6）被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列的串联质谱方法(MS-MS)从头测序。
（7）被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列的非串联质谱方法(MS-MS)的从头测序。
（8）被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列的扣除法推定测序。
（9）被共价交联固定化的配体多肽与受体蛋白质相互作用的位点的片段序列确定是否需要重新解开交联，如果必须如此是否可行，应该如何选择交联剂。
（10）分支状肽链的结构的质谱与非质谱确定方法。
（11）肽链的分支状共价修饰结构的质谱与非质谱确定方法。
5.配体多肽-受体蛋白质的可能的相互作用的位点的序列确定后，用点突变的方法加以验证，并且用实验方法检测和比较突变前后的配体多肽与受体蛋白质相互作用的结合力的数值的变化。
     以上每一条都具体的对应的内容（包括研究实例），没有留下空白的标题。因为内容很多，我先把提纲回答给你，然后会把提纲填充上具体的内容。时间不会很长。31楼的帖子序号没有了，所以重贴。
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33楼2013-09-19 11:22:59
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
5.配体多肽-受体蛋白质的可能的相互作用的位点的序列确定后，用点突变的方法加以验证，并且用实验方法检测和比较突变前后的配体多肽与受体蛋白质相互作用的结合力的数值的变化。
这部分用SRP技术，即Surface plasmon resonance。
Surface plasmon resonance (SPR) is the collective oscillation of electrons in a solid or liquid stimulated by incident light. The resonance condition is established when the frequency of light photons matches the natural frequency of surface electrons oscillating against the restoring force of positive nuclei. SPR in nanometer-sized structures is called localized surface plasmon resonance.

SPR is the basis of many standard tools for measuring adsorption of material onto planar metal (typically gold and silver) surfaces or onto the surface of metal nanoparticles. It is the fundamental principle behind many color-based biosensor applications and different lab-on-a-chip sensors.
摘自：
http://en.wikipedia.org/wiki/Surface_plasmon_resonance
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34楼2013-09-19 14:24:44
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