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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 实时荧光定量PCR过程问题
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孙小爽

铁虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量PCR过程问题 已有2人参与

用ABI7500在进行实时荧光定量时，退火温度一定要60℃吗？还是根据引物来？每次的结果都有黄色的三角符号出现在上面，是引物出现问题吗？
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1楼 2013-08-28 17:09:54
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跳舞的骆驼

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-29 21:14:24
退火温度不一定是60度,根据引物来制定退火温度的.另外,如果可能,你的引物务必要在常规的pcr上实验下,确定退火温度以及最主要的是没有引物二聚体. 结果中出现了黄三角是因为你的产物出现了非特异性扩增,或者你的引物二聚体特别多.
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4楼2013-08-29 08:44:38
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普通回帖

咆哮的白菜

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-29 21:14:15
引物的退火温度当然要看你设计的引物了，退火温度高在60度以上就可以两步法，低的话就三步法，都是根据引物合成报告单上的温度设定的。ABI没用过，第二个问题没法回答。
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姥姥不疼，舅舅不爱
2楼2013-08-28 20:32:49
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孙小爽

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 咆哮的白菜 at 2013-08-28 20:32:49
引物的退火温度当然要看你设计的引物了，退火温度高在60度以上就可以两步法，低的话就三步法，都是根据引物合成报告单上的温度设定的。ABI没用过，第二个问题没法回答。

很感谢，还请问在realtime之前需要用引物和cDNA做一下常规pcr确定退火温度和引物可否适用吗？
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3楼2013-08-29 08:29:28
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孙小爽

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 跳舞的骆驼 at 2013-08-29 08:44:38
退火温度不一定是60度,根据引物来制定退火温度的.另外,如果可能,你的引物务必要在常规的pcr上实验下,确定退火温度以及最主要的是没有引物二聚体. 结果中出现了黄三角是因为你的产物出现了非特异性扩增,或者你的引物 ...

那麻烦请问您 需要怎样设计引物减少非特异性扩增呢？谢谢
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5楼2013-08-29 08:48:52
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咆哮的白菜

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-29 21:14:31
引用回帖:
3楼: Originally posted by 孙小爽 at 2013-08-29 08:29:28
很感谢，还请问在realtime之前需要用引物和cDNA做一下常规pcr确定退火温度和引物可否适用吗？...

做预实验，先用cDNA在不同的退火温度下做荧光定量，看扩增曲线和融解曲线，用两个曲线最好的温度进行正式的荧光定量。其实严格意义上来说，是要先做标准曲线的，不过由于太麻烦，大家好像都省略了。
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姥姥不疼，舅舅不爱
6楼2013-08-29 10:24:35
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wxl007777

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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有黄三角的，看qs summary中有说明的
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7楼2013-08-29 16:21:59
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yilunanxia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
两步法最后貌似都是60℃。所以可以试试三步法啊。
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8楼2013-08-30 09:15:23
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朔颖

新虫 (初入文坛)
您好，请问三角的问题如何解决的啊

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9楼2018-03-12 09:27:55
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bbqlhb

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 朔颖 at 2018-03-12 09:27:55
您好，请问三角的问题如何解决的啊

若果是复孔，很多时候是ct值的SD值太高。就是加样要准确。还有另外一些情况，详细在QC summary中可以看到
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10楼2018-03-13 09:09:32
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