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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR之数据处理

大家好，我在做QPCR对于仪器自动设定的荧光阈值有点困惑，想请教下高手。
我用的是Stratagene mx3000p QPCR仪。
1 完全相同的东西，仪器2次做给的荧光阈值不同；
2 不同基因一起做，将2个基因全选中读取数据时给的荧光阈值是相同的，但是如果单个基因分开选中荧光阈值不同。
我研究的是不同成熟度杨梅的特定基因的表达差异，必须保证同个基因的不同样品荧光阈值相同，这样可以分析该基因的表达差异。但是不能比较不同基因之间的表达差异，因为不同基因荧光阈值仪器设定的不同。是这样吗？
如果我在上面的基础，加上不同品种杨梅的比较，2个品种的杨梅5个成熟度A基因表达差异比较，仪器分2次做，一次一个品种，由于仪器设定的荧光阈值不同，是要先调成一致吗？手调的话可能不是在阈值合适的位置，查资料是说要在3-15个循环偏差的10倍。
下面的图是仪器上的阈值设置选项，好像不是所说的3-15个循环偏差的10倍，看不懂，麻烦高手指点啊！感激不尽！！！
QPCR之数据处理
psb.jpg
QPCR之数据处理-1
IMG20130810171714.jpg



[ Last edited by shiliyusly on 2013-8-10 at 22:14 ]
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1楼 2013-08-10 22:11:53
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-29 13:01:06
1.你调阈值最好把扩增曲线调出来。这样能直观看到选择的是不是对数期。
2。我习惯将一次实验的所有基因都选一个阈值（主要是图方便）
3.不同次的实验阈值一般都是不同的。毕竟不同次的扩增可能差异比较大。
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3楼2013-09-29 10:52:30
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wolong1984

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-29 13:01:02
荧光阈值有差异是正常的，你主要看的是Ct值，一般情况下荧光阈值对Ct值得影响（尤其是Ct值较大的时候）很小。
赞一下 回复此楼
2楼2013-09-29 10:37:55
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