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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白诱导表达低或不表达
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

[求助] 蛋白诱导表达低或不表达

以前表达蛋白一直是包涵体的问题,这次头一次遇到诱导不出来的:
第一张图是IPTG诱导前和诱导后的对比,几乎没有差别.蛋白大小应该是92kDa,只能看到很浅的条带
可以肯定的是蛋白是可溶的,因为以前表达过这个蛋白,这一次我在蛋白N端的his-tag后面添了几个氨基酸,增加了一个酶切位点,便于纯化后把histag切掉,结果谁想就不表达了
表达条件是LB, 19度,1mM IPTG,过夜
BL21 DE3 codon plus, pet28质粒
其实以前这个蛋白一直有诱导表达量不好的问题. 第2张图,右边的7个泳道是同样这个蛋白但是我没有在histag后面添加个酶切位点.左边7个泳道是另一个蛋白用同一个载体质粒,完全一致的插入位点和完全一致的诱导条件,就诱导表达得很好
亲们有什么优化意见吗?
蛋白诱导表达低或不表达
histevh1induction.jpg


蛋白诱导表达低或不表达-1
ecatbody_and_hish1.jpg

[ Last edited by fuyuandj86 on 2013-8-9 at 22:47 ]
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
1楼 2013-08-09 22:42:24
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fuyuandj86: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-08-10 01:25:19
关键问题是你要干啥？都能看见带了纯化出来干啥不够啊？不用担心了，摇500ml, 纯出来做实验吧。。。
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Let'sdoit.
2楼2013-08-10 00:28:34
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
引用回帖:
2楼: Originally posted by yimingwang at 2013-08-10 00:28:34
关键问题是你要干啥？都能看见带了纯化出来干啥不够啊？不用担心了，摇500ml, 纯出来做实验吧。。。

主要是第一张图,N端添加了7个氨基酸以后诱导前诱导后几乎没差别了...
这个是要用来做高通量筛选.
以第二张图右边组的诱导量还是可以接受的,我摇了10L,最后搞出来6-7mg
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3楼2013-08-10 01:22:38
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-08-10 12:02:18
fuyuandj86: 金币+8, ★★★★★最佳答案, 恩恩,老板也是这么说的,回去再测序查查错>_< 2013-08-10 22:06:28
简单的加个酶切位点就发生了如此大的变化，一般是不可能的，所以我建议你在此测序看看，确保没有移码！
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互助互励，共奋共进！！
4楼2013-08-10 06:50:08
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
fuyuandj86: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-08-14 01:24:34
nature以前有一篇论文专门讨论了稀有氨基酸对蛋白表达影响很大，所以我觉得还是非常有可能变小的，移码可能性不大。我的蛋白表达量是楼主的1/N,SDS-PAGE上看不到差别，Western才能看到表达。多摇点，纯出来就好了。
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Let'sdoit.
5楼2013-08-11 15:16:07
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