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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达诱导蛋白
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科技广场

铜虫 (小有名气)

[求助] 原核表达诱导蛋白

请问大家原核表达诱导蛋白时用的IPTG浓度是多少？，跑SDS-PAGE电泳的时候，菌体破碎后上清跟菌体分开分别上样吗？谢谢
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1楼 2013-07-24 11:22:52
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 12:09:11
科技广场: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-07-25 10:32:53
37度 3-4小时诱导，可以1mM，这样表达会快点，但是前提是你的蛋白不是说很么特殊的蛋白
16度过夜的话，一般都是0.5mM以下了，因为要温和诱导。
iptg过量会影响你的蛋白表达，有时候还会抑制，所以要慎用！

跑SDS-PAGE电泳的时候，菌体破碎后上清跟菌体分开分别上样，因为这是判断你的蛋白是否可溶的标准，所以需要的。
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修身、齐家、治国、平天下
2楼2013-07-24 11:59:27
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zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
科技广场: 金币+2, ★有帮助 2013-07-25 10:33:06
自己做个IPTG浓度梯度 一般IPTG终浓度0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L 。包括诱导温度和诱导时间都要自己摸索一下，最合适的表达条件才拿到更多的重组蛋白。
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3楼2013-07-24 14:53:08
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hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
2楼、3楼正解，祝楼主顺利啊，呵呵
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4楼2013-07-24 16:29:44
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科技广场

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by alicelchf at 2013-07-24 11:59:27
37度 3-4小时诱导，可以1mM，这样表达会快点，但是前提是你的蛋白不是说很么特殊的蛋白
16度过夜的话，一般都是0.5mM以下了，因为要温和诱导。
iptg过量会影响你的蛋白表达，有时候还会抑制，所以要慎用！

跑S ...

可是菌体破碎后，离心后上清跟菌体分不大开
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5楼2013-07-25 10:35:24
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alicelchf

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 科技广场 at 2013-07-25 10:35:24
可是菌体破碎后，离心后上清跟菌体分不大开...

那就主要看你的蛋白在不在你的上清就可以判断是否可溶了
因为再离心沉淀也会有一些目标蛋白的
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修身、齐家、治国、平天下
6楼2013-07-25 11:42:30
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科技广场

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhuzhicheng at 2013-07-24 14:53:08
自己做个IPTG浓度梯度 一般IPTG终浓度0.01mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.5mmol/L 。包括诱导温度和诱导时间都要自己摸索一下，最合适的表达条件才拿到更多的重组蛋白。

可是我现在直接不能诱导出蛋白，优化条件还有用吗？
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7楼2013-09-09 08:34:24
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夏至1990

金虫 (小有名气)

小小虫
引用回帖:
5楼: Originally posted by 科技广场 at 2013-07-25 10:35:24
可是菌体破碎后，离心后上清跟菌体分不大开...

离心转速太低吧。和上清分清，就12000g。10min，4摄氏°
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Sodoyouwanttotakealeapoffaith…orbecomeanoldman,filledwithregret…waitingtodiealone?
8楼2014-04-22 15:37:48
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