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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量过程中污染的问题 切切！！
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学术问题

银虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量过程中污染的问题 切切！！

首先：提取RNA 后，是先进行RNA的混合好还是反转录后cDNA的混合好。
其次：荧光定量过程中（已经成cDNA）,所用的枪头、八连管、去离子水需要用DEPC处理吗，或者哪些需要处理？还有对粉状引物稀释用的去离子水是不是只需要灭菌就行了，不需要DEPC处理?

本人新手 还望海涵！！
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微生物小硕
1楼 2013-07-19 10:01:16
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hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
学术问题(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-19 11:57:19
学术问题: 金币+2, ★有帮助 2013-07-19 20:55:37
depc就是RNase抑制剂，是用来防止RNA降解的，已经是cdna了，就没必要了
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2楼2013-07-19 10:52:50
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
学术问题(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-19 11:57:28
第一句话没看明白，是混合什么啊？
荧光定量PCR的时候所用耗材要求没有那么严格的，耗材高压灭菌就可以，豪放一点的高压灭菌也可以省去。水我正常是用超纯水，去离子水水问题应该也不大，需要注意的是避免交叉污染，阴性对照可以检测。
引物溶解灭菌后的去离子水是可以用的。
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3楼2013-07-19 11:00:17
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li201018

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
学术问题(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-19 11:57:39
检测的是mRNA表达量，所以是先混RNA（这时的RNA浓度一定要一致）后反转录。
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低调！务实！
4楼2013-07-19 11:08:53
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangweida2 at 2013-07-19 11:00:17
第一句话没看明白，是混合什么啊？
荧光定量PCR的时候所用耗材要求没有那么严格的，耗材高压灭菌就可以，豪放一点的高压灭菌也可以省去。水我正常是用超纯水，去离子水水问题应该也不大，需要注意的是避免交叉污染 ...

我是第0,1,2,3,4,5,6，7，……40天 分别对实验组和对照组取样。后提取RNA。是先把实验组和对照组的RNA分别等量混合后反转录cDNA ,还是先把实验组和对照组的RNA反转录成cDNA后、在进行等量混合？？我觉得都是一样的啊，我觉得是先反转录好，如果是先对RNA混合的话，RNA容易降解。是不是啊？
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微生物小硕
5楼2013-07-19 21:02:50
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by li201018 at 2013-07-19 11:08:53
检测的是mRNA表达量，所以是先混RNA（这时的RNA浓度一定要一致）后反转录。

我是第0,1,2,3,4,5,6，7，……40天 分别对实验组和对照组取样。后提取RNA。是先把实验组和对照组的RNA分别等量混合后反转录cDNA ,还是先把实验组和对照组的RNA反转录成cDNA后、在进行等量混合？？我觉得都是一样的啊，我觉得是先反转录好，如果是先对RNA混合的话，RNA容易降解。是不是啊？
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微生物小硕
6楼2013-07-19 21:03:03
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real-time

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-22 11:46:36
可以尝试一下一步法逆转录，不一定非要分步骤做的
减少步骤，减少失误的可能
现在一步法逆转录也相当成熟了
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一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
7楼2013-07-22 08:36:40
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huayueyang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

建议用致癌物DEPO无毒替代品外源RNA酶清除剂简单喷洒处理一下台面，器具，耗材就行。
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坚持！
8楼2013-08-04 00:08:07
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