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ginnyzhuzhu

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[求助] 求助western-blot实验前的准备工作？一抗二抗怎么确定？

我在做真核原核表达，蛋白检测想用western-blot,但是现在实验室没有师兄师姐会，想请教一下实验之前需要准备什么，一抗二抗怎么确定？是设计好让生物公司合成吗？要怎么设计呢？

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1楼 2013-07-12 11:21:09

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-12 13:27:11
ginnyzhuzhu: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢呐~ 2013-07-14 10:47:38

你需要制备蛋白样品，跑SDS-PAGE，转膜，封闭，然后用抗体孵育，最后显影。如果你做的表达带标签，一般公司有卖抗标签的一抗，直接买就行了。二抗是根据一抗的来源，常见的是鼠或者兔的，选择抗一抗IgG的抗体，来源无所谓。二抗是偶联酶的，常用的有过氧化物酶或者碱性磷酸酶。

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2楼2013-07-12 11:55:13

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xiaopingzi22

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我们做的时候自己把通路确定好，然后确定引物序列（这个比较麻烦，网上查的，像medline啥的都可以，定试剂的公司是老师推荐的，具体不记得了，之后要通过正常人实验反复验证其是否正确）。一抗貌似也是让公司给直接提供的，二抗就是抗一抗的，好多都可以通用。方法啥的网上基本都有，也差不多都，关键是前期预实验要做好，再正式开始实验。

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3楼2013-12-07 23:06:03

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