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chxiuagoing

新虫 (初入文坛)

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[求助] 蛋白复性问题

各位高手，求助蛋白复性问题。我的蛋白是高浓度的包涵体表达，我的复性方法是先用1%TritonX-100,50mMNaCl洗涤两次，再用8M的尿素溶解，离心，加复性液：GSH:GSSG=10：1，PH=8.0的PBS,静置1h左右，离心，透析（24h）;透析结束没有发现有沉淀，酶活检测发现没有酶活，SDS-PAGE发现有目的条带。。。求指教。。。谢谢！！！！

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1楼 2013-07-11 16:14:30

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pennchem

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【答案】应助回帖

同样的缓冲液，逐步降低尿素的浓度，（比如从在6M尿素中透析，然后4M，然后2M，依次降低）降低到0.1M左右的时候，再测酶活性

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行至水穷处，坐看云起时

3楼2013-08-11 18:14:04

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linxt2005

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【答案】应助回帖

这种情况应该目的蛋白没有正常折叠，虽然是可溶状态，但是没有活性。
可以尝试改变一下复性条件，比如增加一些其他组分，比如Glycerol，Arginine等；
或者更改一下复性的方法，比如柱复性或者快速稀释法。

复性有时是个缓慢的过程，对温度也有影响，需要延长复性时间，寻找合适温度。

如果多种尝试后未果，建议在可溶表达上下工夫，可以优化表达条件或更换载体、表达系统。

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小兵一个

2楼2013-08-08 13:20:20

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