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关于蛋白复性问题，急急急
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我采用透析复性，尿素浓度从8-6-4-2-0M。请问氧化还原剂（我用的是GSH/GSSG体系）应该在那个透析阶段加入？是加入到透析液里吧？（不是样品中） [ Last edited by 落枫林 on 2011-10-20 at 13:36 ] |
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【答案】应助回帖
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蛋白质的复性 蛋白质复性的最大问题，是在复性过程中形成中间体和多聚体，中间体阻碍作用大的使蛋白质正确折叠困难，复性就困难；阻碍小或无阻碍的容易复性。降低蛋白浓度可以减少中间体形成提高复性率。减少中间体的形成，可选用添加小分子物质，又叫分子伴侣，如精氨酸、甘油、PEG等小分子物质帮助蛋白质正确折叠。避免多聚体的形成可以加入氧化还原剂（DTT、ß－ME、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、Cu2＋等），帮助蛋白质复性中二硫键的正确配对，减少错配率。 复性缓冲液的pH要远离等电点，离子强度不易过高，10－50mmol/L，离子强度太高蛋白质易发生沉淀，也不利于离子交换层析的分离；复性液温度不易过高在4℃－10℃较合适对于耐热蛋白也可以室温复性。复性时间，以天然表达的重组蛋白复性应在6hr以上，需要进行酶切的融和表达重组蛋白，至少要复性1hr以上，方可进行进一步的酶切。 复性方式：常用的有透析复性和稀释复性。透析复性适用于小样品制备；对于大样品制备，采用稀释复性法简便、实用。一般包含体蛋白的复性浓度不易过大，不同的蛋白质有所区别，一般掌握在100－200ug/ml较合适，蛋白浓度太稀使纯化流程过长，蛋白浓度太浓，蛋白质复性不完全，会直接影响蛋白的回收率。直接稀释有困难的，也可以试用分段稀释法。 蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，这个最佳条件的选择是靠大量的实验来完成的。只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。 |
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