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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白复性问题
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chxiuagoing

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白复性问题

各位高手，求助蛋白复性问题。我的蛋白是高浓度的包涵体表达，我的复性方法是先用1%TritonX-100,50mMNaCl洗涤两次，再用8M的尿素溶解，离心，加复性液：GSH:GSSG=10：1，PH=8.0的PBS,静置1h左右，离心，透析（24h）;透析结束没有发现有沉淀，酶活检测发现没有酶活，SDS-PAGE发现有目的条带。。。求指教。。。谢谢！！！！
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1楼 2013-07-11 16:14:30
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这种情况应该目的蛋白没有正常折叠，虽然是可溶状态，但是没有活性。
可以尝试改变一下复性条件，比如增加一些其他组分，比如Glycerol，Arginine等；
或者更改一下复性的方法，比如柱复性或者快速稀释法。

复性有时是个缓慢的过程，对温度也有影响，需要延长复性时间，寻找合适温度。

如果多种尝试后未果，建议在可溶表达上下工夫，可以优化表达条件或更换载体、表达系统。
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小兵一个
2楼2013-08-08 13:20:20
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

同样的缓冲液，逐步降低尿素的浓度，（比如从在6M尿素中透析，然后4M，然后2M，依次降低）降低到0.1M左右的时候，再测酶活性
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行至水穷处，坐看云起时
3楼2013-08-11 18:14:04
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2008101111

金虫 (正式写手)

学术江湖混子

【答案】应助回帖

建议用8M尿素溶解后静置一段时间后，采用梯度稀释的方法是尿素浓度降低到2M左右，再加入氧化还原系统来还原二硫键，复性时间延长，透析过程小心，别把蛋白弄没了
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自主创业者，捣腾生物试剂
4楼2013-08-11 21:22:12
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jing井妮

银虫 (小有名气)
请问楼主最后的蛋白复性是怎么做的？
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5楼2014-09-16 15:13:08
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