| 查看: 2694 | 回复: 5 | |||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||
pianyuner金虫 (正式写手)
|
[求助]
提取DNA后，PCR电泳无条带
|
||||
|
手提DNA后，测定浓度在100-200ng/ml，稀释至70ng/ml后，配置出PCR体系，跑电泳，只有Maker有条带，其他的都无条带，阳性对照条带呈柱状，又长又不清晰。做了三次都是这个结果，自己实在找不到原因，第一次做分子实验，请大家多多指教。 PS：我的药品没有问题，师姐用同样的药品做出了结果，我也可以保证我的药品没有添加错。 谢谢！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 核酸生物学实验经验 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有227人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- PCR电泳图求解
已经有13人回复
- 单链DNA大小为100np,PCR后跑电泳，条带在200bp左右是怎么回事？求助！！
已经有4人回复
- DNA电泳后，空白对照总是出现一个弱条带，重赏！
已经有19人回复
- PCR后跑电泳，整个泳道都很亮，怎么回事？
已经有5人回复
- 总dna电泳有条带，但PCR后只有引物二聚体
已经有23人回复
- 试剂盒提取细菌DNA后，跑胶检测有条带，但是PCR后却无扩增产物。
已经有10人回复
- 5 RACE inner-PCR电泳结果无条带，是怎么回事？
已经有4人回复
- 这样的电泳图片是否代表PCR扩增成功了？
已经有26人回复
- 琼脂糖电泳没有条带，但是DNA浓度很高，1000+ng/ul maker有条带
已经有7人回复
- DNA提取测序，DNA提取后，电泳条带弥散拖尾
已经有7人回复
- 请教RNA提取高手：反转录PCR（RT-PCR)中DNA的去除
已经有18人回复
- 土壤中含有农药，提取的土壤DNA进行PCR扩增，农药会抑制PCR反应吗
已经有5人回复
- PCR后电泳条带异常
已经有10人回复
- 大家帮忙分析一下PCR电泳图
已经有14人回复
- PCR后凝胶电泳条带时有时无是怎么回事？
已经有5人回复
- 【求助/交流】质粒DNA可以不通过酶切直接跑电泳检测吗？
已经有24人回复
- 【求助/交流】PCR产物电泳检测
已经有20人回复
- 【求助/交流】目的基因PCR后电泳出现多条带
已经有7人回复
- 【求助/交流】（5.20更新）PCR产物电泳没有条带，why?
已经有20人回复
- 【求助/交流】提取的植物基因组DNA电泳图，疑问？？？
已经有17人回复
- 【求助/交流】DNA跑胶2ul有目的带很清晰，但是胶回收时，上样量为20ul时跑电泳却降解�
已经有17人回复
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-06-24 18:42:54
pianyuner(amisking代发): 金币+3, 鼓励发帖交流！ 2013-06-24 18:43:03
pianyuner: 金币+1, ★有帮助 2013-06-26 10:23:31
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-06-24 18:42:54
pianyuner(amisking代发): 金币+3, 鼓励发帖交流！ 2013-06-24 18:43:03
pianyuner: 金币+1, ★有帮助 2013-06-26 10:23:31
|
应该是假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。Mg2+离子浓度从1.0mmol/L分梯度上升，最高不能超过10 0.1mmol/L. 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 |
4楼2013-06-24 18:20:59
jiangronglu
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 10478.3
- 散金: 104
- 红花: 9
- 帖子: 2893
- 在线: 328.1小时
- 虫号: 1793748
- 注册: 2012-05-03
- 性别: GG
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
2楼2013-06-24 16:32:05
武穆大成
木虫 (著名写手)
笨蛋
- 应助: 79 (初中生)
- 金币: 3506.5
- 散金: 344
- 红花: 3
- 帖子: 1574
- 在线: 228.5小时
- 虫号: 1743585
- 注册: 2012-04-08
- 专业: 免疫生物学
3楼2013-06-24 18:05:27
凌波丽
专家顾问 (知名作家)
-
专家经验: +218 - MolEPI: 44
- 应助: 397 (硕士)
- 贵宾: 0.044
- 金币: 2118.9
- 散金: 10
- 红花: 208
- 帖子: 5633
- 在线: 571.6小时
- 虫号: 1766465
- 注册: 2012-04-19
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
- 管辖: 生物科学综合
5楼2013-06-24 18:34:48
