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16srDNA

铜虫 (初入文坛)

[求助] 如何做2个定点突变（2个终止密码子换掉）

读文献有几个问题不太懂，特向各位大神求助

有一段目的基因待表达 (支原体的一段基因，要在大肠杆菌中表达），表达前要把这段基因的2个终止密码子换掉，文献中用了3对引物（1对flanking region引物，2对含有mutation引物--每对引物都是overlap的），我的问题是这两个定点突变是怎么做的？

希望大神们帮帮忙，小女子拜谢
附上那篇文献
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1楼 2013-06-15 18:53:01
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sun_in_night

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 16srDNA at 2013-06-15 21:23:56
谢谢你的回复。待表达的基因来自支原体，UGA在支原体中不是终止密码子，但是现在要克隆到pETHIS-1载体上在BL21中表达...

像楼上说的，overlap其实是比较麻烦的，如果不差钱的话还是建议直接买一个site-directed mutagenesis kit，很快的，效率也很高，能节约大量的时间。特别是你要突变两个位点，会更繁琐。不过如果你要换的其中一个位点直接在最后的话，你就设计的引物时候把它改了就行，另一个你就得定点突变了。然后就看你选overlap还是用试剂盒了。
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7楼2013-06-16 01:58:49
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
16srDNA(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-16 10:42:35
换终止密码子不用定点突变吧，直接克隆基因的时候，在你设计的引物上去掉终止密码子就行了呀。不是很懂的是为什么会有两个终止密码子？
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2楼2013-06-15 21:05:49
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16srDNA

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-06-15 21:05:49
换终止密码子不用定点突变吧，直接克隆基因的时候，在你设计的引物上去掉终止密码子就行了呀。不是很懂的是为什么会有两个终止密码子？

谢谢你的回复。待表达的基因来自支原体，UGA在支原体中不是终止密码子，但是现在要克隆到pETHIS-1载体上在BL21中表达
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3楼2013-06-15 21:23:56
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16srDNA

铜虫 (初入文坛)
我也不清楚这叫不叫定点突变，就是想把两个不同位置的终止密码子换掉，文献中给的两对引物是overlap的，但是文献中引用的文献9，我看不出有什么关联。。。

再附上文献9，求大神指导，小女子不胜感激
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    • 2013-06-15 21:35:59, 3.48 M
4楼2013-06-15 21:36:14
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