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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » DEAE——Sepharose离子交换纯化 流速变慢
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小李爱学习

铜虫 (正式写手)

[求助] DEAE——Sepharose离子交换纯化 流速变慢

在做DEAE——Sepharose Fast Flow离子交换纯化酶的研究，是用的NaCl梯度洗脱，刚开始流速正常，但经过7-8小时后流速就变慢了，需要再次提高泵的转速，之后7-8小时后再次变慢，需要再次提高泵的转速；
我用的是2年前师姐用过的柱材料，分离效果还不错，但就是出现流速变慢的情况；蠕动泵是上海沪西的；上样前样液已经过0.44um膜过滤了；是NaCl浓度逐渐增加导致的问题吗？我上样的体积比较大，是不是样品量太大把柱子堵了?但是梯度洗脱前用缓冲液冲洗杂蛋白的时候没有堵啊？
还是别的原因请各位高手给小弟分析分析。

[ Last edited by 小李爱学习 on 2013-5-29 at 10:42 ]
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1楼 2013-05-29 09:53:07
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小李爱学习: 金币+2, ★有帮助 2013-05-30 23:27:15
我觉得是你泵的原因。时间一长就不能恒速。我一般样品0.2μm的膜过滤。柱子是你自装的吗，体积多少？过7-8小时，这时间未免太长。
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2楼2013-05-29 13:41:11
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小李爱学习: 金币+5, ★★★很有帮助, 我也是打算下一步这么做的，多谢 2013-05-31 08:10:20
是你长时间上样，柱子压缩了，把柱子重悬应该就可以了。还有你的柱子用了那么长时间，可能有部分分解成更小的颗粒了，堵住了你的膜！
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3楼2013-05-29 15:45:58
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小李爱学习: 金币+1, ★有帮助, 填料没有变化，柱子装好后都是用较高流速压实了的 2013-05-31 08:09:49
填料变软了？你看看柱床体积变小了没。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2013-05-29 16:01:56
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小李爱学习: 金币+2, ★有帮助, 没有压力测量工具 2013-05-31 08:08:43
不知道楼主有没有注意过压力，压力有没有变化，
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5楼2013-05-30 15:37:21
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小李爱学习

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-05-29 13:41:11
我觉得是你泵的原因。时间一长就不能恒速。我一般样品0.2μm的膜过滤。柱子是你自装的吗，体积多少？过7-8小时，这时间未免太长。

我觉得是有些堵了，体积300ml。你一般上样体积是多少，这个填料好像吸附能力很强，我上样很多 超过200ml都不会把目标蛋白漏出。
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6楼2013-05-30 23:27:02
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ynkuaile

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
wizardfan: 金币+3, 谢谢补充 2013-05-31 08:21:19
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小李爱学习 at 2013-05-30 23:27:02
我觉得是有些堵了，体积300ml。你一般上样体积是多少，这个填料好像吸附能力很强，我上样很多 超过200ml都不会把目标蛋白漏出。...

其实其他人说的都对，都是该考虑的地方，我为何只说泵的原因是因为我觉得你过柱子的装置。你用的泵是国产的蠕动泵，他的原理就是3个铁杆旋转推动压紧的皮管往前出水，流速是通过铁杆与皮管压紧程度来控制的，所以我觉得时间一长他压紧的程度就不准了，变松了，流速就慢了。此外3楼4楼说的很对，手动装的柱子，时间一长，填料是会被压缩的，5楼说的是非常正确的，是这个问题的关键。可惜你没法检测压力，不好观察。现在你能够得到目标蛋白就算顺利，考虑下一步试验赶紧做。如果非要改进，我觉得你过柱时间真的太长了，7-8小时，之后再7-8小时。蛋白与树脂结合力很强可以提高流速，担心压力大压坏填料的话就换粗一点的柱子。我用GE的5mL预装柱，一般流速5mL/min,上样怕不结合我会降低到3mL/min,洗脱洗20个柱体积。还是很快的。仅供参考。
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7楼2013-05-31 00:41:59
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小李爱学习

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-05-31 00:41:59
其实其他人说的都对，都是该考虑的地方，我为何只说泵的原因是因为我觉得你过柱子的装置。你用的泵是国产的蠕动泵，他的原理就是3个铁杆旋转推动压紧的皮管往前出水，流速是通过铁杆与皮管压紧程度来控制的，所以我 ...

谢谢你的指点
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8楼2013-05-31 08:08:19
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