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小李爱学习

银虫 (正式写手)

[求助] DEAE——Sepharose离子交换纯化 流速变慢

在做DEAE——Sepharose Fast Flow离子交换纯化酶的研究,是用的NaCl梯度洗脱,刚开始流速正常,但经过7-8小时后流速就变慢了,需要再次提高泵的转速,之后7-8小时后再次变慢,需要再次提高泵的转速;
我用的是2年前师姐用过的柱材料,分离效果还不错,但就是出现流速变慢的情况;蠕动泵是上海沪西的;上样前样液已经过0.44um膜过滤了;是NaCl浓度逐渐增加导致的问题吗?我上样的体积比较大,是不是样品量太大把柱子堵了?但是梯度洗脱前用缓冲液冲洗杂蛋白的时候没有堵啊?
还是别的原因请各位高手给小弟分析分析。

[ Last edited by 小李爱学习 on 2013-5-29 at 10:42 ]
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小李爱学习

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ynkuaile at 2013-05-29 13:41:11
我觉得是你泵的原因。时间一长就不能恒速。我一般样品0.2μm的膜过滤。柱子是你自装的吗,体积多少?过7-8小时,这时间未免太长。

我觉得是有些堵了,体积300ml。你一般上样体积是多少,这个填料好像吸附能力很强,我上样很多 超过200ml都不会把目标蛋白漏出。
6楼2013-05-30 23:27:02
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ynkuaile

木虫 (小有名气)

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★ ★
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小李爱学习: 金币+2, 有帮助 2013-05-30 23:27:15
我觉得是你泵的原因。时间一长就不能恒速。我一般样品0.2μm的膜过滤。柱子是你自装的吗,体积多少?过7-8小时,这时间未免太长。
2楼2013-05-29 13:41:11
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edoz1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小李爱学习: 金币+5, ★★★很有帮助, 我也是打算下一步这么做的,多谢 2013-05-31 08:10:20
是你长时间上样,柱子压缩了,把柱子重悬应该就可以了。还有你的柱子用了那么长时间,可能有部分分解成更小的颗粒了,堵住了你的膜!
3楼2013-05-29 15:45:58
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖


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小李爱学习: 金币+1, 有帮助, 填料没有变化,柱子装好后都是用较高流速压实了的 2013-05-31 08:09:49
填料变软了?你看看柱床体积变小了没。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2013-05-29 16:01:56
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