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DEAE——Sepharose离子交换纯化 流速变慢
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在做DEAE——Sepharose Fast Flow离子交换纯化酶的研究，是用的NaCl梯度洗脱，刚开始流速正常，但经过7-8小时后流速就变慢了，需要再次提高泵的转速，之后7-8小时后再次变慢，需要再次提高泵的转速； 我用的是2年前师姐用过的柱材料，分离效果还不错，但就是出现流速变慢的情况；蠕动泵是上海沪西的；上样前样液已经过0.44um膜过滤了；是NaCl浓度逐渐增加导致的问题吗？我上样的体积比较大，是不是样品量太大把柱子堵了?但是梯度洗脱前用缓冲液冲洗杂蛋白的时候没有堵啊？ 还是别的原因请各位高手给小弟分析分析。 [ Last edited by 小李爱学习 on 2013-5-29 at 10:42 ] |
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wizardfan: 金币+3, 谢谢补充 2013-05-31 08:21:19
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其实其他人说的都对，都是该考虑的地方，我为何只说泵的原因是因为我觉得你过柱子的装置。你用的泵是国产的蠕动泵，他的原理就是3个铁杆旋转推动压紧的皮管往前出水，流速是通过铁杆与皮管压紧程度来控制的，所以我觉得时间一长他压紧的程度就不准了，变松了，流速就慢了。此外3楼4楼说的很对，手动装的柱子，时间一长，填料是会被压缩的，5楼说的是非常正确的，是这个问题的关键。可惜你没法检测压力，不好观察。现在你能够得到目标蛋白就算顺利，考虑下一步试验赶紧做。如果非要改进，我觉得你过柱时间真的太长了，7-8小时，之后再7-8小时。蛋白与树脂结合力很强可以提高流速，担心压力大压坏填料的话就换粗一点的柱子。我用GE的5mL预装柱，一般流速5mL/min,上样怕不结合我会降低到3mL/min,洗脱洗20个柱体积。还是很快的。仅供参考。 |
7楼2013-05-31 00:41:59
ynkuaile
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