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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达跑胶检测不到产物
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半生一梦

木虫 (小有名气)

[求助] 原核表达跑胶检测不到产物

本人从去年11月份断断续续做原核表达至今 一直都没有成功表达
目的基因连接的是pet-28a载体 受体细胞选择bl21(de3)
载体和大肠杆菌实验室的师姐都用来做过表达 是ok的
表达载体在转到bl21(de3)之前也送去测序过 没有问题
诱导条件也尝试过37度3h和20度18h两种
iptg浓度从0.1mM到1mM也做过优化
来来回回page胶跑了也有十几二十块了 自己做的胶没有跑出来 拜托师姐做的胶也没跑出来
所以一直很纠结啊 求高人指点！
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1楼2013-05-27 20:25:03
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
半生一梦: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-28 21:21:17
跑得是全菌蛋白吗？序列中是否有很多稀有密码子？参考LS的建议，换菌株试试。
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3楼2013-05-28 08:30:24
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普通回帖

wodezxn

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
半生一梦(amisking代发): 金币+1, 鼓励新虫发帖交流，欢迎常来！ 2013-05-27 21:14:20
不是每个蛋白都能成功表达的，可以考虑换个载体试试，GST或者pet系列的其他载体，也能是稀有密码的问题导致真核蛋白不能在原核中表达，可以将bl21换成Rossta菌株（号称万能翻译菌株）试试。
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2楼2013-05-27 20:32:15
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
半生一梦(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 02:04:26
pET28有his tag，WB检测一下，如果有痕量表达可以换表达菌株，优化发酵条件。如果没有，换载体，N端融合大标签尝试。
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4楼2013-05-28 11:13:52
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半生一梦

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wodezxn at 2013-05-27 20:32:15
不是每个蛋白都能成功表达的，可以考虑换个载体试试，GST或者pet系列的其他载体，也能是稀有密码的问题导致真核蛋白不能在原核中表达，可以将bl21换成Rossta菌株（号称万能翻译菌株）试试。

非常感谢 另外我还想咨询下
我的基因片段在设计引物双酶切连接载体的时候对序列需要进行什么处理么？
我是把信号肽的部分去掉了 然后在紧接着信号肽的地方设计的上游引物
但是下游引物设计的时候没有把orf全部包含进去 大概少了十几个碱基
这样会不会对表达有影响呢
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5楼2013-05-28 21:12:54
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半生一梦

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by roomofxw at 2013-05-28 11:13:52
pET28有his tag，WB检测一下，如果有痕量表达可以换表达菌株，优化发酵条件。如果没有，换载体，N端融合大标签尝试。

wb做过了 也看不到表达 纠结死了
试验室合适的表达菌株貌似也就这一个
问我们这边一个博士后在读的老师 他就坚定的认为肯定能表达 不可能表达不出来 晕
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6楼2013-05-28 21:20:26
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-05-29 16:00:05
半生一梦(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 19:15:20
重测质粒重新转化，多挑几个菌落进行表达吧。
菌株的话，找一些小公司买一个感受态几百元钱，也很快。
当然后手，最好还是换个载体挂上trx啊，NusA啊等大标签表达一下试一试了。买个载体，酶切位点都能找到一样的，转换一下应该还是不难的。毕竟就算28表达出来的话，产量不高，还有可能有可溶性问题，到时候还得换着试
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7楼2013-05-29 08:54:21
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roomofxw

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 半生一梦 at 2013-05-28 21:12:54
非常感谢 另外我还想咨询下
我的基因片段在设计引物双酶切连接载体的时候对序列需要进行什么处理么？
我是把信号肽的部分去掉了 然后在紧接着信号肽的地方设计的上游引物
但是下游引物设计的时候没有把orf全部包 ...

主要是确保密码子不产生移码情况。自然下游也最好加上终止密码子。
测序结果从ATG开始，翻译一下看看有没有问题就行了。
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8楼2013-05-29 08:57:47
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wodezxn

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 半生一梦 at 2013-05-28 21:12:54
非常感谢 另外我还想咨询下
我的基因片段在设计引物双酶切连接载体的时候对序列需要进行什么处理么？
我是把信号肽的部分去掉了 然后在紧接着信号肽的地方设计的上游引物
但是下游引物设计的时候没有把orf全部包 ...

不要发生移码就行，但是表不表达就看人家菌株愿不愿意了，好多时间不是你想让他表达就能表达的，明白？这就是实验，没有什么是一定的。
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9楼2013-05-30 08:04:51
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jiamengao

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
半生一梦: 金币+2, ★有帮助 2013-05-31 21:02:16
如果实验室只有一个菌株，那说明你们做蛋白表达不是强项，所以有表达不出来的很正常。我做原核表达常有表达不出来的。我觉得做原核表达最重要的就是筛载体和菌株，至于其它的条件，虽然很重要，但是我觉得不如载体和菌株的作用更具决定性。我见过一个实验室做原核表达，目的片段上入门载体后，直接gateway重组到几十个表达载体上全试一遍。
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10楼2013-05-30 16:02:33
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