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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达跑胶检测不到产物
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半生一梦

木虫 (小有名气)

[求助] 原核表达跑胶检测不到产物

本人从去年11月份断断续续做原核表达至今 一直都没有成功表达
目的基因连接的是pet-28a载体 受体细胞选择bl21(de3)
载体和大肠杆菌实验室的师姐都用来做过表达 是ok的
表达载体在转到bl21(de3)之前也送去测序过 没有问题
诱导条件也尝试过37度3h和20度18h两种
iptg浓度从0.1mM到1mM也做过优化
来来回回page胶跑了也有十几二十块了 自己做的胶没有跑出来 拜托师姐做的胶也没跑出来
所以一直很纠结啊 求高人指点！
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1楼 2013-05-27 20:25:03
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jiamengao

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
半生一梦: 金币+2, ★有帮助 2013-05-31 21:02:16
如果实验室只有一个菌株，那说明你们做蛋白表达不是强项，所以有表达不出来的很正常。我做原核表达常有表达不出来的。我觉得做原核表达最重要的就是筛载体和菌株，至于其它的条件，虽然很重要，但是我觉得不如载体和菌株的作用更具决定性。我见过一个实验室做原核表达，目的片段上入门载体后，直接gateway重组到几十个表达载体上全试一遍。
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10楼2013-05-30 16:02:33
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wodezxn

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
半生一梦(amisking代发): 金币+1, 鼓励新虫发帖交流，欢迎常来！ 2013-05-27 21:14:20
不是每个蛋白都能成功表达的，可以考虑换个载体试试，GST或者pet系列的其他载体，也能是稀有密码的问题导致真核蛋白不能在原核中表达，可以将bl21换成Rossta菌株（号称万能翻译菌株）试试。
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2楼2013-05-27 20:32:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
半生一梦: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-28 21:21:17
跑得是全菌蛋白吗？序列中是否有很多稀有密码子？参考LS的建议，换菌株试试。
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3楼2013-05-28 08:30:24
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
半生一梦(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 02:04:26
pET28有his tag，WB检测一下，如果有痕量表达可以换表达菌株，优化发酵条件。如果没有，换载体，N端融合大标签尝试。
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4楼2013-05-28 11:13:52
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