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虫海小卒

银虫 (正式写手)

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专业: 高分子合成化学

[求助] His标签蛋白纯化

大家好，最近实验中碰到两个关于镍螯合磁性琼脂糖微球的问题，在此向各位前辈请教，请不吝赐教：
1.首先我做的是4B磁性琼脂糖，不需要进行装柱，经改性后接枝了氨基二乙酸做螯合配基，其中氨基二乙酸的接枝量为90umol/mL左右，但进行镍螯合后，镍离子含量只有45umol/mL左右，也就是说镍的螯合效率只有50%，为什么呢？其中我螯合镍的时候尝试过锥形瓶中摇床振荡、离心管中垂直混合，但镍的螯合效率一直提高不上去。
2.经螯合镍后，在做His-tag标签蛋白纯化时，结合的蛋白用25mM的咪唑就可以洗脱下来，一般的产品需要在50或100mM的咪唑才能将目标蛋白洗脱，为什么呢？能否有好的办法让咪唑的洗脱浓度提高？如下图：E1、E2和E3分别为吸附目标蛋白后，用25、100和500mM的咪唑洗脱。

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