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十三-小样

铜虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量pcr,以及内参基因的选择。

我克隆了一个鱼的以前不知道序列的基因。2700bp。我想做一个荧光定量PCR，该如何做？我的初步想法是找这个鱼的管家基因做内参，分别设计合成内参和目的基因的荧光定量PCR引物，然后就可以做了对吗？但是这个鱼的管家基因没找到，能不能用其他鱼类的代替？这样做出来的荧光定量PCR有意义吗？以前没做过，谢谢高手指点。
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走好眼前每一步
1楼 2013-05-09 16:59:55
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十三-小样

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaolf at 2013-05-10 10:40:38
1.就一个目的基因和一个内参这样做相对定量有意义吗？
即使只有目的基因和内参基因的相对定量，也是有意义的。
2.要不要做一个cdna浓度梯度什么的？
这个浓度梯度是在做qRT-PCR之前检测引物扩增效率的，目的基因 ...

你太厉害了，谢谢。我又找到几个别人做过的该基因的同源基因，并且有现成的荧光定量PCR引物，我准备借用过来做对照。
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走好眼前每一步
5楼2013-05-10 11:19:27
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
十三-小样(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-05-10 08:36:10
十三-小样: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-05-10 09:26:00
1，你做qPCR的意义何在？确定了有必要做，然后进行下一步。
2，找管家基因可以按你的方法，可以选择几个备用的，在不同的组织或者不同的阶段（就是用不同的材料）试试，选择一个到两个用来做你的内参。
3，若你要做目的基因的话，就按qPCR的引物设计条件，设计合适的引物呗。
最最重要的就是，你要确定为什么要做qPCR，能解释什么问题，在整个实验设计中起到什么作用。
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2楼2013-05-09 23:03:08
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十三-小样

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 新人小玥 at 2013-05-09 23:03:08
1，你做qPCR的意义何在？确定了有必要做，然后进行下一步。
2，找管家基因可以按你的方法，可以选择几个备用的，在不同的组织或者不同的阶段（就是用不同的材料）试试，选择一个到两个用来做你的内参。
3，若你要 ...

拿到基因以后，做点工作，将来有东西写，这是初步目的。做Qrt-pcr定量分析。恩，我准备设计内参和目的基因的荧光定量PCR引物，先用普通PCR试试，看能否出条带，出条带再做荧光定量PCR，就一个目的基因和一个内参这样做相对定量有意义吗？要不要做一个cdna浓度梯度什么的？内参还不确定能不能出条带，只能摸着石头过河了。
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走好眼前每一步
3楼2013-05-10 09:25:40
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zhaolf

木虫 (著名写手)

胖虎爱唱歌

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
十三-小样: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-05-10 11:19:36
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-10 13:02:22
十三-小样: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 谢谢你。QRT-PCR已做完，就还没处理数据 2013-05-29 21:30:04
引用回帖:
3楼: Originally posted by 十三-小样 at 2013-05-09 17:25:40
拿到基因以后，做点工作，将来有东西写，这是初步目的。做Qrt-pcr定量分析。恩，我准备设计内参和目的基因的荧光定量PCR引物，先用普通PCR试试，看能否出条带，出条带再做荧光定量PCR，就一个目的基因和一个内参这 ...

1.就一个目的基因和一个内参这样做相对定量有意义吗？
即使只有目的基因和内参基因的相对定量，也是有意义的。
2.要不要做一个cdna浓度梯度什么的？
这个浓度梯度是在做qRT-PCR之前检测引物扩增效率的，目的基因和内参基因的引物都要做。
3.你说的没错，目前首要任务是选择好的内参基因，祝你好运！
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我是胖虎，我是孩子王！
4楼2013-05-10 10:40:38
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