| 查看: 3730 | 回复: 10 | |||
| 本帖产生 1 个 MicEPI ，点击这里进行查看 | |||
crazymouse66金虫 (正式写手)
|
[求助]
绝对定量荧光PCR中做标准曲线的DNA的获得。
|
||
| 虫友们好，最近我想用16SRNA做一下土壤总DNA的 绝对定量荧光PCR，在这之前要做一条标准曲线，我就想问一下，做标准曲线时的已知浓度的DNA是怎么获得的？而且我接下来做的是从土壤中提取的中DNA的16sRNA的荧光定量PCR，因此我做标准曲线的一直浓度的DNA有什么要求吗？请大家帮帮忙。或者给我相应的参考文献也可以，谢谢大家。 |
回复此楼» 本帖已获得的红花（最新10朵）
丹66» 猜你喜欢
考研调剂
已经有5人回复
-
267一志愿南京工业大学0817化工求调剂
已经有6人回复
-
293求调剂
已经有4人回复
-
285化工学硕求调剂（081700）
已经有7人回复
-
302求调剂
已经有8人回复
-
08工科 320总分 求调剂
已经有3人回复
-
290求调剂
已经有9人回复
-
271求调剂
已经有13人回复
-
本人考085602 化学工程 专硕
已经有16人回复
-
304求调剂
已经有7人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 实时荧光定量 相对定量 标准曲线的问题
已经有10人回复
- 荧光定量PCR扩增效率低
已经有16人回复
- 荧光定量pcr溶解曲线好几个峰，但是电泳只有一条目的条带，怎么回事
已经有5人回复
- 荧光定量PCR ，条件优化
已经有13人回复
- 有做过荧光定量PCR的吗？
已经有9人回复
- RT-qPCR实验问题
已经有23人回复
- 荧光定量PCR实验技术
已经有15人回复
- 荧光定量PCR。。。求助求助
已经有17人回复
- 荧光PCR，想做标准曲线
已经有4人回复
- 荧光pcr标准曲线问题
已经有21人回复
- 荧光定量PCR
已经有12人回复
- 荧光定量PCR标准曲线的建立
已经有3人回复
- 荧光定量PCR扩增效率怎么做？？？？我要被逼疯了
已经有17人回复
- 都有哪些非培养的细菌计数方法？
已经有9人回复
- 相对定量PCR求助
已经有16人回复
- 标准菌株建立荧光定量PCR的标准曲线
已经有5人回复
- 【分享】荧光定量PCR简介
已经有13人回复
- 【求助/交流】关于荧光定量PCR中cdna合成的问题
已经有12人回复
- 【分享】荧光定量PCR实验指南（一）
已经有20人回复
wubingqi
木虫 (小有名气)
- MicEPI: 1
- 应助: 79 (初中生)
- 金币: 5264.9
- 散金: 10
- 红花: 15
- 帖子: 242
- 在线: 514.8小时
- 虫号: 1049797
- 注册: 2010-06-30
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 真的非常感谢，我以前都没做过这个，所以对此很不熟悉，谢谢你的帮助，让我大概有了一些了解，我先自己再查阅一些文献，有不懂的再请教您，谢谢啊。 2013-05-07 11:20:07
zhang8826857: 金币+5, MicEPI+1, good 2013-05-10 16:27:48
zhang8826857: 有兴趣来做本版的专家吗？ 2013-05-10 16:28:12
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 真的非常感谢，我以前都没做过这个，所以对此很不熟悉，谢谢你的帮助，让我大概有了一些了解，我先自己再查阅一些文献，有不懂的再请教您，谢谢啊。 2013-05-07 11:20:07
zhang8826857: 金币+5, MicEPI+1, good 2013-05-10 16:27:48
zhang8826857: 有兴趣来做本版的专家吗？ 2013-05-10 16:28:12
|
这个最好是用带有目的片段的质粒作标准曲线，因为质粒相对稳定，不易降解。你首先要选择一个16s rDNA序列测定完毕的纯菌，你可以从的环境样品中随便分离一个细菌，用高保真酶扩增16s rDNA保守区域（比如V3区），然后通过连接载体转化后测序，然后你就知道这个片段(V3)的精确大小了。然后，重新用扩增那个细菌的这个片段（V3）,pcr产物连接合适的载体（单克隆质粒，并只有一个克隆位点的），连接成功后转化，摇菌培养，然后从摇好的菌液中再提取这个带有目的片段质粒。下一步就是测定质粒的浓度和纯度了，测OD值即可，一般来说260nm吸光度下，1OD≈50mg/mL双链DNA，这样你就知道了你提取的带有目的片段的质粒的浓度了。因为载体的大小和目的片段（那个V3区）大小都已知，然后通过公式即可算出质粒的拷贝数，这个质粒的拷贝数和目的片段的拷贝数是一样的。最后，将这个质粒进行5倍或是10倍的梯度稀释，用这一系列的质粒上机荧光定量PCR做标准曲线就行了。 早上比较忙，介绍的有点混乱，不好意思 |
2楼2013-05-07 09:10:44
crazymouse66
金虫 (正式写手)
- 应助: 12 (小学生)
- 金币: 3657.7
- 散金: 140
- 红花: 4
- 帖子: 551
- 在线: 112.6小时
- 虫号: 1441792
- 注册: 2011-10-14
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2013-05-10 09:03:55
wubingqi
木虫 (小有名气)
- MicEPI: 1
- 应助: 79 (初中生)
- 金币: 5264.9
- 散金: 10
- 红花: 15
- 帖子: 242
- 在线: 514.8小时
- 虫号: 1049797
- 注册: 2010-06-30
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
4楼2013-05-10 09:22:12
crazymouse66
金虫 (正式写手)
- 应助: 12 (小学生)
- 金币: 3657.7
- 散金: 140
- 红花: 4
- 帖子: 551
- 在线: 112.6小时
- 虫号: 1441792
- 注册: 2011-10-14
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
5楼2013-05-10 11:14:08
6楼2013-09-18 15:48:31
7楼2014-02-21 09:19:34
8楼2014-11-29 19:54:55
9楼2018-06-11 15:18:30
10楼2019-11-05 16:46:11
20