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crazymouse66金虫 (正式写手)
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绝对定量荧光PCR中做标准曲线的DNA的获得。
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| 虫友们好，最近我想用16SRNA做一下土壤总DNA的 绝对定量荧光PCR，在这之前要做一条标准曲线，我就想问一下，做标准曲线时的已知浓度的DNA是怎么获得的？而且我接下来做的是从土壤中提取的中DNA的16sRNA的荧光定量PCR，因此我做标准曲线的一直浓度的DNA有什么要求吗？请大家帮帮忙。或者给我相应的参考文献也可以，谢谢大家。 |
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wubingqi
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这个最好是用带有目的片段的质粒作标准曲线，因为质粒相对稳定，不易降解。你首先要选择一个16s rDNA序列测定完毕的纯菌，你可以从的环境样品中随便分离一个细菌，用高保真酶扩增16s rDNA保守区域（比如V3区），然后通过连接载体转化后测序，然后你就知道这个片段(V3)的精确大小了。然后，重新用扩增那个细菌的这个片段（V3）,pcr产物连接合适的载体（单克隆质粒，并只有一个克隆位点的），连接成功后转化，摇菌培养，然后从摇好的菌液中再提取这个带有目的片段质粒。下一步就是测定质粒的浓度和纯度了，测OD值即可，一般来说260nm吸光度下，1OD≈50mg/mL双链DNA，这样你就知道了你提取的带有目的片段的质粒的浓度了。因为载体的大小和目的片段（那个V3区）大小都已知，然后通过公式即可算出质粒的拷贝数，这个质粒的拷贝数和目的片段的拷贝数是一样的。最后，将这个质粒进行5倍或是10倍的梯度稀释，用这一系列的质粒上机荧光定量PCR做标准曲线就行了。 早上比较忙，介绍的有点混乱，不好意思 |
2楼2013-05-07 09:10:44
crazymouse66
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3楼2013-05-10 09:03:55
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