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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
crazymouse66: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 真的非常感谢,我以前都没做过这个,所以对此很不熟悉,谢谢你的帮助,让我大概有了一些了解,我先自己再查阅一些文献,有不懂的再请教您,谢谢啊。 2013-05-07 11:20:07
zhang8826857: 金币+5, MicEPI+1, good 2013-05-10 16:27:48
zhang8826857: 有兴趣来做本版的专家吗? 2013-05-10 16:28:12
这个最好是用带有目的片段的质粒作标准曲线,因为质粒相对稳定,不易降解。你首先要选择一个16s rDNA序列测定完毕的纯菌,你可以从的环境样品中随便分离一个细菌,用高保真酶扩增16s rDNA保守区域(比如V3区),然后通过连接载体转化后测序,然后你就知道这个片段(V3)的精确大小了。然后,重新用扩增那个细菌的这个片段(V3),pcr产物连接合适的载体(单克隆质粒,并只有一个克隆位点的),连接成功后转化,摇菌培养,然后从摇好的菌液中再提取这个带有目的片段质粒。下一步就是测定质粒的浓度和纯度了,测OD值即可,一般来说260nm吸光度下,1OD≈50mg/mL双链DNA,这样你就知道了你提取的带有目的片段的质粒的浓度了。因为载体的大小和目的片段(那个V3区)大小都已知,然后通过公式即可算出质粒的拷贝数,这个质粒的拷贝数和目的片段的拷贝数是一样的。最后,将这个质粒进行5倍或是10倍的梯度稀释,用这一系列的质粒上机荧光定量PCR做标准曲线就行了。
早上比较忙,介绍的有点混乱,不好意思
2楼2013-05-07 09:10:44
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