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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 绝对定量荧光PCR中做标准曲线的DNA的获得。
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crazymouse66

金虫 (正式写手)

[求助] 绝对定量荧光PCR中做标准曲线的DNA的获得。

虫友们好，最近我想用16SRNA做一下土壤总DNA的 绝对定量荧光PCR，在这之前要做一条标准曲线，我就想问一下，做标准曲线时的已知浓度的DNA是怎么获得的？而且我接下来做的是从土壤中提取的中DNA的16sRNA的荧光定量PCR，因此我做标准曲线的一直浓度的DNA有什么要求吗？请大家帮帮忙。或者给我相应的参考文献也可以，谢谢大家。
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丹66 lm8023

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1楼 2013-05-07 08:44:26
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feipiaolw

新虫 (初入文坛)
质粒DNA的扩增效率和线性的基因组可能不一致，因为质粒会形成超螺旋，影响引物和模板结合，所以最好是质粒酶切为线性后作为标曲的DNA模板。
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学术一点，挺好的，要坚持
6楼2013-09-18 15:48:31
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wubingqi

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
crazymouse66: 金币+50, ★★★★★最佳答案, 真的非常感谢，我以前都没做过这个，所以对此很不熟悉，谢谢你的帮助，让我大概有了一些了解，我先自己再查阅一些文献，有不懂的再请教您，谢谢啊。 2013-05-07 11:20:07
zhang8826857: 金币+5, MicEPI+1, good 2013-05-10 16:27:48
zhang8826857: 有兴趣来做本版的专家吗？ 2013-05-10 16:28:12
这个最好是用带有目的片段的质粒作标准曲线，因为质粒相对稳定，不易降解。你首先要选择一个16s rDNA序列测定完毕的纯菌，你可以从的环境样品中随便分离一个细菌，用高保真酶扩增16s rDNA保守区域（比如V3区），然后通过连接载体转化后测序，然后你就知道这个片段(V3)的精确大小了。然后，重新用扩增那个细菌的这个片段（V3）,pcr产物连接合适的载体（单克隆质粒，并只有一个克隆位点的），连接成功后转化，摇菌培养，然后从摇好的菌液中再提取这个带有目的片段质粒。下一步就是测定质粒的浓度和纯度了，测OD值即可，一般来说260nm吸光度下，1OD≈50mg/mL双链DNA，这样你就知道了你提取的带有目的片段的质粒的浓度了。因为载体的大小和目的片段（那个V3区）大小都已知，然后通过公式即可算出质粒的拷贝数，这个质粒的拷贝数和目的片段的拷贝数是一样的。最后，将这个质粒进行5倍或是10倍的梯度稀释，用这一系列的质粒上机荧光定量PCR做标准曲线就行了。
早上比较忙，介绍的有点混乱，不好意思
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2楼2013-05-07 09:10:44
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crazymouse66

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wubingqi at 2013-05-07 09:10:44
这个最好是用带有目的片段的质粒作标准曲线，因为质粒相对稳定，不易降解。你首先要选择一个16s rDNA序列测定完毕的纯菌，你可以从的环境样品中随便分离一个细菌，用高保真酶扩增16s rDNA保守区域（比如V3区），然后 ...

您好，请问您有相应的参考文献吗？我想看一下相应的参考文献，请提供一下参考文献的名字就可以了，谢谢啊。
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3楼2013-05-10 09:03:55
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wubingqi

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by crazymouse66 at 2013-05-10 09:03:55
您好，请问您有相应的参考文献吗？我想看一下相应的参考文献，请提供一下参考文献的名字就可以了，谢谢啊。...

你看下《土壤中粉红粘帚霉67_1荧光定量PCR监测体系的建立及应用》这个论文吧，时间久了，只记得这么一个了。
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crazymouse66
4楼2013-05-10 09:22:12
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