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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » cDNA凝胶电泳结果分析
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foxhuli

木虫 (正式写手)

[交流] cDNA凝胶电泳结果分析

这是我的cDNA PCR结果，麻烦大家帮忙分析一下，因为我们实验室几乎不涉及这一块，我也是偶然做这一部分。从人肝癌细胞中提取的RNA，然后经RT-PCR，逆转录成cDNA。电泳我用的是1.5%琼脂糖，1*TBE，65V，90min，每孔10μl左边两个是RNA，中间是1kb mark，右边两个是pcr产物，有专业人士能看一下这是否p成功了吗？

RNA,DNA.jpg
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1楼 2013-05-01 17:11:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dafeizizhu

铜虫 (小有名气)
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gyesang: 回帖置顶 2013-05-02 12:06:14
foxhuli(gyesang代发): 金币+2, 热心的虫子，忠言逆耳！ 2013-05-02 12:06:56
foxhuli: 金币+2 2013-05-02 20:57:44
首先，绝大多数人看电泳图都是点样孔在上边，偶尔有人这样放的。这就是另类。其次，要让人看明白电泳图，必须使用图片处理软件将每个电泳孔都标注清楚了。下面我来说说关于cDNA问题：一般情况下，要检验RNA提取结果如何，好的RNA是明显的两条带，28s和18s，大小分别在1900bp和1000bp左右，28s条带亮度是18s条带亮度的1-2倍，这样的RNA才是好的，才可以用来做cDNA。再者，要检测cDNA质量也行，cDNA合成试剂盒一般情况下都会给对照mRNA，合成cDNA过程中，一起做这个对照，它的产物是一条1400bp的条带（takara试剂盒是这样的），电泳检测时，如果对照出现了1400bp条带，说明你整个cDNA反转录过程是没有问题的。正式样品的条带，就应该看你使用的是什么引物了，如果是试剂盒给的olig引物，产物是弥散的条带，没有特异条带。如果你使用的是特异引物，也就是你自己合成的目的基因的引物，那产物就是一条带，多了不对。从图中看，RNA提取就是问题，跟不用说后面实验了。
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9楼2013-05-02 10:03:14
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
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foxhuli(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 12:07:08
楼主PCR的目的片段式多长呢？RNA有降解，但是逆转录还是可以逆出cDNA出来，逆了cDNA后可以P个内参（GAPDH）来检测下cDNA是否有问题。如果没有问题就可以进行PCR你的目的条带了。。。但是首先你得知道的目的片段是多长啊。。。
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10楼2013-05-02 10:09:36
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nmhsd

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没有哪位大神会告诉你能从cDNA电泳看出来是否RT成功。继续做下面的吧！
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11楼2013-05-02 11:04:51
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普通回帖

renzhiq

木虫 (小有名气)
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foxhuli(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-01 21:03:32
你的表述有点问题，没有明白你是用cDNA做模板进行pcr还是直接检测反转录的情况，cDNA质量（很少有人会这么做）
不管怎么样，您右边都是没有产物的。实验没有成功！
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2楼2013-05-01 19:26:03
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foxhuli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by renzhiq at 2013-05-01 19:26:03
你的表述有点问题，没有明白你是用cDNA做模板进行pcr还是直接检测反转录的情况，cDNA质量（很少有人会这么做）
不管怎么样，您右边都是没有产物的。实验没有成功！

就是用RNA进行逆转录的啊，那如何检测是否成功呢
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3楼2013-05-01 22:10:36
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foxhuli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by renzhiq at 2013-05-01 19:26:03
你的表述有点问题，没有明白你是用cDNA做模板进行pcr还是直接检测反转录的情况，cDNA质量（很少有人会这么做）
不管怎么样，您右边都是没有产物的。实验没有成功！

就是用RNA进行逆转录的啊，那如何检测是否成功呢
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4楼2013-05-01 22:11:00
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andywang6137

木虫 (著名写手)
★ ★
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foxhuli(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-02 12:05:17
为什么不把图像正放过来呢？检测也是直接电泳检测RNA，几乎没有人检测反转录后的cDNA，反转录试剂还是比较贵的。右边2个孔只有引物二聚体，没有PCR产物。
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6楼2013-05-02 08:36:54
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renzhiq

木虫 (小有名气)
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foxhuli(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 12:05:30
检测很简单啊。你用通用引物，以cDNA为模板进行扩增，再跑胶就可以了……
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7楼2013-05-02 09:23:20
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guaiyaya

铜虫 (初入文坛)
★
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你的CDNA片段是多长？
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8楼2013-05-02 09:25:44
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foxhuli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by dafeizizhu at 2013-05-02 10:03:14
首先，绝大多数人看电泳图都是点样孔在上边，偶尔有人这样放的。这就是另类。其次，要让人看明白电泳图，必须使用图片处理软件将每个电泳孔都标注清楚了。下面我来说说关于cDNA问题：一般情况下，要检验RNA提取结果 ...

谢谢哦，新手上路，太容易开到河里去了。受教
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12楼2013-05-02 20:55:33
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foxhuli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by nmhsd at 2013-05-02 11:04:51
没有哪位大神会告诉你能从cDNA电泳看出来是否RT成功。继续做下面的吧！

恩，继续重复
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13楼2013-05-02 20:57:19
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
9楼: Originally posted by dafeizizhu at 2013-05-02 10:03:14
首先，绝大多数人看电泳图都是点样孔在上边，偶尔有人这样放的。这就是另类。其次，要让人看明白电泳图，必须使用图片处理软件将每个电泳孔都标注清楚了。下面我来说说关于cDNA问题：一般情况下，要检验RNA提取结果 ...

希望我们共同进步
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14楼2013-05-07 15:40:48
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foxhuli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by dafeizizhu at 2013-05-02 10:03:14
首先，绝大多数人看电泳图都是点样孔在上边，偶尔有人这样放的。这就是另类。其次，要让人看明白电泳图，必须使用图片处理软件将每个电泳孔都标注清楚了。下面我来说说关于cDNA问题：一般情况下，要检验RNA提取结果 ...

打扰，我还想问一下，是不是只要是同一个物种，GSTπ基因序列是一样的呢？  嘿嘿 ，外行了
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15楼2013-05-11 18:39:48
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yingying15885楼
2013-05-01 22:27   回复  
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