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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 荧光pcr阴性对照有扩增
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颜英

铜虫 (小有名气)

[求助] 荧光pcr阴性对照有扩增 已有2人参与

最近在做荧光pcr，阴性对照老是有扩增，刚开始以为是引物污染了，就用新的引物，结果还是有扩增；以为是水有问题，就用买的dd水，还是有扩增，这回就剩没换mix了，我这样排除对吗？为森马阴性对照会有扩增呢？
请各位大侠帮帮忙，跪谢啊
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1楼 2013-04-18 22:22:23
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颜英

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-20 03:23:12
你的负对照的模板是什么？RNA样品反转不加逆转录酶还是以水为模板？如果是前者，是样品里的基因组DNA没消化干净，如果是后者，说明体系有污染。...

阴性对照的模板是水，引物也换了，水也换了，枪也洗了，反应体系也换了，还是有扩增，天哪，问题到底出在哪，神啊，告诉我吧
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8楼2013-04-23 21:02:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxingc: 金币+1, 欢迎常到微生物版 2013-04-19 08:44:11
扩增产物熔解曲线峰值与正常产物是否相同？做原核还是真核？引物是否跨内含子？做反转录前的RNA样品DNase消化是否完全？
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2楼2013-04-19 05:46:29
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励积极回帖帮助解答问题 2013-04-24 08:58:15
应该先确定阴性对照里扩增出来的东西是不是和你的目标产物一样，及看看melt curve的出峰温度是不是一样，如果是一样的就是有污染，你有没有额外加Mg？此外操作要小心，可能你定量的基因很广谱，容易污染，可以到超净台里再试试。
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3楼2013-04-19 12:33:09
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颜英

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-19 05:46:29
扩增产物熔解曲线峰值与正常产物是否相同？做原核还是真核？引物是否跨内含子？做反转录前的RNA样品DNase消化是否完全？

溶解曲线基本重合，做的是原核，沙门氏菌。。。我今天换了mix，还是有扩增，是不是枪的原因啊，我用84洗了枪，不知道会不会有效果。。。。
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4楼2013-04-19 16:24:23
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