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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 荧光pcr阴性对照有扩增
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颜英

铜虫 (小有名气)

[求助] 荧光pcr阴性对照有扩增 已有2人参与

最近在做荧光pcr，阴性对照老是有扩增，刚开始以为是引物污染了，就用新的引物，结果还是有扩增；以为是水有问题，就用买的dd水，还是有扩增，这回就剩没换mix了，我这样排除对吗？为森马阴性对照会有扩增呢？
请各位大侠帮帮忙，跪谢啊
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1楼 2013-04-18 22:22:23
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励积极回帖帮助解答问题 2013-04-24 08:58:15
应该先确定阴性对照里扩增出来的东西是不是和你的目标产物一样，及看看melt curve的出峰温度是不是一样，如果是一样的就是有污染，你有没有额外加Mg？此外操作要小心，可能你定量的基因很广谱，容易污染，可以到超净台里再试试。
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3楼2013-04-19 12:33:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhangxingc: 金币+1, 欢迎常到微生物版 2013-04-19 08:44:11
扩增产物熔解曲线峰值与正常产物是否相同？做原核还是真核？引物是否跨内含子？做反转录前的RNA样品DNase消化是否完全？
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2楼2013-04-19 05:46:29
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颜英

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-19 05:46:29
扩增产物熔解曲线峰值与正常产物是否相同？做原核还是真核？引物是否跨内含子？做反转录前的RNA样品DNase消化是否完全？

溶解曲线基本重合，做的是原核，沙门氏菌。。。我今天换了mix，还是有扩增，是不是枪的原因啊，我用84洗了枪，不知道会不会有效果。。。。
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4楼2013-04-19 16:24:23
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, 鼓励积极发帖帮助解答问题 2013-04-24 08:58:28
可能是出现了非特异性扩增带。
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高（大于10mmol/L)、退火温度过低，及PCR循环次数过多（超过30次循环）有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

再有是：模板(靶基因)核酸的量与纯化程度。模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
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5楼2013-04-19 17:57:52
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