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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建表达载体PBI121阳性对照
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蛋白之家

新虫 (小有名气)

[交流] 构建表达载体PBI121阳性对照 已有3人参与

昨天做的转化，卡那霉素是近两天配制的，浓度是50微克，用PBI121质粒和目的片段涂板子，前者就出现就出现这样的情况，但是目的片段转化后不长斑，重复的很多次结果都一样，是怎么回事？
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1楼 2013-04-13 09:46:38
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wxf8470

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2013-04-16 16:43:25
要保证121质粒彻底被切开，如果是双酶切，两个酶切位点太近的话要考虑分开切，分开回收；如果单酶切考虑磷酸酶处理，不过从你的描述没有自连不是单切。
回收后跑电泳检查质量和初步判断数量。
第二步考虑连接效率，改变两个片段的比例；16度连接过夜。
考虑转化效率，感受态细胞质量是关键；据说电激比热激的高。

[ Last edited by wxf8470 on 2013-4-13 at 06:44 ]
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2楼2013-04-13 19:43:25
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wxf8470 at 2013-04-13 19:43:25
要保证121质粒彻底被切开，如果是双酶切，两个酶切位点太近的话要考虑分开切，分开回收；如果单酶切考虑磷酸酶处理，不过从你的描述没有自连不是单切。
回收后跑电泳检查质量和初步判断数量。
第二步考虑连接效率 ...

谢谢你的回复！我酶切后跑了电泳，片段大小也合适应该不是单酶切。可能是没有连接上，我会继续加长时间连接看看。
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3楼2013-04-16 11:15:51
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wangqi1107

银虫 (小有名气)
★
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阳性对照长了没？连接之前测一下，载体和目的片段的浓度，1:3-1:10比较好。连接过夜。kana浓度用50ng/L。
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4楼2013-04-16 16:40:07
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蛋白之家

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangqi1107 at 2013-04-16 16:40:07
阳性对照长了没？连接之前测一下，载体和目的片段的浓度，1:3-1:10比较好。连接过夜。kana浓度用50ng/L。

谢谢！我的基因长斑了，挑了斑后，菌液PCR，能扩出来且与基因质粒片段大小相同，但是121质粒用我的基因引物也能扩出来，现在不知道啥情况？我想现在做一下酶切，如果能切下来是不是就合适呢？
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5楼2013-04-17 16:52:53
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紫萱遗落

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 蛋白之家 at 2013-04-17 16:52:53
谢谢！我的基因长斑了，挑了斑后，菌液PCR，能扩出来且与基因质粒片段大小相同，但是121质粒用我的基因引物也能扩出来，现在不知道啥情况？我想现在做一下酶切，如果能切下来是不是就合适呢？...

我也是用的这俩个酶切位点，我想问一下菌液PCR是用自己的引物跑得吗？我一个都没有啊，你是用什么引物啊？谢谢哈~~
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6楼2013-10-29 10:21:36
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