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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求指点 PCR结果分析
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sunzhengwang

铁虫 (小有名气)

[求助] 求指点 PCR结果分析



cDNA做成之后，加了引物做PCR结果出来了二条带，很奇怪；
怀疑是引物问题： 重新换新的，结果还是一样；
重复一次，结果一样，
难道是cDNA的问题？  各路神仙帮忙指点一下吧。
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一手生存，一手梦想
1楼 2013-04-01 15:01:46
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bingdong05

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
sunzhengwang(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-31 23:11:34
有目的条带出现即可，pcr出现非特异性条带很正常的，若消除非特异性条带可以适当提高退火温度
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2楼2013-04-01 15:09:49
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牧歌ping

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助，节日愉快 2013-04-01 15:58:38
你扩增的目的基因是否含有内含子？若是有内含子，可能是你逆转前RNA中混杂的DNA没有除尽，所以扩增出现的两条带一条是由DNA为模板扩出，一条是由逆转后的cDNA扩出。若没有内含子，可能是你的引物设计时特异性不高与多个位点结合，或者是退火温度有点低出现了非特异性扩增。
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3楼2013-04-01 15:37:15
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sunzhengwang

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bingdong05 at 2013-04-01 15:09:49
有目的条带出现即可，pcr出现非特异性条带很正常的，若消除非特异性条带可以适当提高退火温度

也有可能是引物二聚体啊
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一手生存，一手梦想
4楼2013-04-02 10:11:48
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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应该用相应的DNA做一个正对照，确定是否cDNA有问题。
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5楼2013-04-02 12:14:06
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zhenwuhuang

至尊木虫 (文学泰斗)

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感谢参与，应助指数 +1
二聚体有可能，但一般分子量很小，容易区分
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6楼2013-04-02 12:49:20
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bingdong05

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
sunzhengwang(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 20:59:03
引用回帖:
4楼: Originally posted by sunzhengwang at 2013-04-02 10:11:48
也有可能是引物二聚体啊...

引物二聚体很小的，你的目的片段多大？另外像5楼的兄弟说的做个阳性对照，用来验证cdna没有问题；若是怀疑rna有基因组污染，直接用rna作为模版做个pcr看看
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7楼2013-04-02 15:11:44
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sunzhengwang

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by bingdong05 at 2013-04-02 15:11:44
引物二聚体很小的，你的目的片段多大？另外像5楼的兄弟说的做个阳性对照，用来验证cdna没有问题；若是怀疑rna有基因组污染，直接用rna作为模版做个pcr看看...

RNA为模版，做PCR这个没做过，请指教
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一手生存，一手梦想
8楼2013-04-02 16:33:20
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sunzhengwang

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhenwuhuang at 2013-04-02 12:49:20
二聚体有可能，但一般分子量很小，容易区分

哦，多谢；
那么提高退火温度，一般提高几度为宜呢，根据你的个人经验？
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一手生存，一手梦想
9楼2013-04-02 16:34:42
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zhenwuhuang

至尊木虫 (文学泰斗)
2度
10楼2013-04-02 16:45:26
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