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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 环境 » 环境生态 » Q_PCR结果，请高手指点一下
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distant616

金虫 (小有名气)

[求助] Q_PCR结果，请高手指点一下

首先，我想问一下，Q_PCR的结果是不是可以正常的跑电泳，应该能够出现目的条带；第二，我的溶解曲线是单峰，扩增曲线也还可以，但是为什么跑电泳，竟然什么也没用呢。第三，NTC也有出现单峰，怀疑是不是被污染了，还有就是标准曲线做的还可以，所以判断并不确定。
一下是扩增曲线和溶解曲线以及跑电泳的结果，请大家帮忙分析一下，谢谢。我这小硕在此感激不尽。
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  • 附件 1 : q-PCRresult.doc
    • 2012-07-12 11:35:25, 121.5 K

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distant616

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1楼2012-07-12 11:37:41
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yanqindeng

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
distant616: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-15 09:29:58
电泳出来这样子的结果是正常的。
我看到标准曲线低浓度的Ct值可能有些偏差，说明引物的扩增效率可能有点低。模板浓度较高时的结果可信（图中前三个点），但模板浓度较低的时候可能有点问题。
即使引物扩增效率较高，引物特异性较好，跑琼脂糖电泳还是可能会出现这样子的结果，具体原因我以前好像在网上看见过，但是想不起来了。
如果你需要产物，最好还是采用普通PCR。
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4楼2012-07-13 17:28:13
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普通回帖

bondy22

铁杆木虫 (著名写手)
看不懂，请高手解答一下吧
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奔与夲
2楼2012-07-12 14:04:23
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vivanslum

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ymnh: 金币+1, 积极参与交流，欢迎常来环境版 2012-07-12 19:37:16
溶解曲线很好啊，都没有杂峰。
那电泳你试过几次了，都是同样结果么？
普通PCR，同样电泳条件都有很清楚的条带么？
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distant616
心若调适，道可得矣；清净安乐，道不失矣
3楼2012-07-12 15:21:03
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distant616

金虫 (小有名气)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by vivanslum at 2012-07-12 15:21:03
溶解曲线很好啊，都没有杂峰。
那电泳你试过几次了，都是同样结果么？
普通PCR，同样电泳条件都有很清楚的条带么？

普通电泳都是P不出来的，电泳我跑过三次，都是相同的结果。
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5楼2012-07-15 09:29:34
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distant616

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yanqindeng at 2012-07-13 17:28:13
电泳出来这样子的结果是正常的。
我看到标准曲线低浓度的Ct值可能有些偏差，说明引物的扩增效率可能有点低。模板浓度较高时的结果可信（图中前三个点），但模板浓度较低的时候可能有点问题。
即使引物扩增效率较高 ...

我样品的顺序是，第一个是NTC，接下来四个是Sample，剩下的三个是质粒。我用普通PCR都P不出来，不知道能否给写什么意见，我的引物条件已经优化了，标准的质粒是能够P出来的，但是样品还是P不出来。
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6楼2012-07-15 09:32:05
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distant616

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yanqindeng at 2012-07-13 17:28:13
电泳出来这样子的结果是正常的。
我看到标准曲线低浓度的Ct值可能有些偏差，说明引物的扩增效率可能有点低。模板浓度较高时的结果可信（图中前三个点），但模板浓度较低的时候可能有点问题。
即使引物扩增效率较高 ...

普通的PCR我P不出来啊，条件已经优化了，用标准质粒做参考，标准质粒是有目的条带的，而我的样品依旧没有。请问，能够给些什么好的意见吗？
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7楼2012-07-15 09:33:34
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yanqindeng

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
bestlike: 金币+1, 鼓励新虫交流！ 2012-07-16 11:28:44
阳性对照P出来，而样品P不出来，可能原因是：1. 样品中目标基因浓度太低，超出检测范围；2. 引物针对的基因可能在你的样品中不存在。
可以考虑：
1. 继续优化，如增加镁离子、BSA牛血清蛋白，产物扩增时间是否够？
2.换引物。每对引物都有自己的扩增范围，不是万能的。
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distant616
8楼2012-07-16 10:57:37
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distant616

金虫 (小有名气)
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引用回帖:
8楼: Originally posted by yanqindeng at 2012-07-16 10:57:37
阳性对照P出来，而样品P不出来，可能原因是：1. 样品中目标基因浓度太低，超出检测范围；2. 引物针对的基因可能在你的样品中不存在。
可以考虑：
1. 继续优化，如增加镁离子、BSA牛血清蛋白，产物扩增时间是否够？ ...

扩增时间肯定在，我觉得是基因浓度太低了，我想知道能够怎么样提高基因浓度呢？
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9楼2012-07-16 18:24:35
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yanqindeng

金虫 (正式写手)
★
bestlike: 金币+1, 鼓励新虫！ 2012-07-17 15:08:07
引用回帖:
9楼: Originally posted by distant616 at 2012-07-16 18:24:35
扩增时间肯定在，我觉得是基因浓度太低了，我想知道能够怎么样提高基因浓度呢？...

那就是把样品模板浓度增加。我以前试过把PCR产物放在高温环境（50-60度）下一段时间（根据样品体积来掌握）后在再回收。需要注意不要烘干了。
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distant616
10楼2012-07-17 14:58:55
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