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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 环境 » 环境生态 » Q_PCR结果，请高手指点一下
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distant616

金虫 (小有名气)

[求助] Q_PCR结果，请高手指点一下

首先，我想问一下，Q_PCR的结果是不是可以正常的跑电泳，应该能够出现目的条带；第二，我的溶解曲线是单峰，扩增曲线也还可以，但是为什么跑电泳，竟然什么也没用呢。第三，NTC也有出现单峰，怀疑是不是被污染了，还有就是标准曲线做的还可以，所以判断并不确定。
一下是扩增曲线和溶解曲线以及跑电泳的结果，请大家帮忙分析一下，谢谢。我这小硕在此感激不尽。
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  • 附件 1 : q-PCRresult.doc
    • 2012-07-12 11:35:25, 121.5 K

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distant616

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1楼2012-07-12 11:37:41
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yanqindeng

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
distant616: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-15 09:29:58
电泳出来这样子的结果是正常的。
我看到标准曲线低浓度的Ct值可能有些偏差，说明引物的扩增效率可能有点低。模板浓度较高时的结果可信（图中前三个点），但模板浓度较低的时候可能有点问题。
即使引物扩增效率较高，引物特异性较好，跑琼脂糖电泳还是可能会出现这样子的结果，具体原因我以前好像在网上看见过，但是想不起来了。
如果你需要产物，最好还是采用普通PCR。
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4楼2012-07-13 17:28:13
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yanqindeng

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
bestlike: 金币+1, 鼓励新虫交流！ 2012-07-16 11:28:44
阳性对照P出来，而样品P不出来，可能原因是：1. 样品中目标基因浓度太低，超出检测范围；2. 引物针对的基因可能在你的样品中不存在。
可以考虑：
1. 继续优化，如增加镁离子、BSA牛血清蛋白，产物扩增时间是否够？
2.换引物。每对引物都有自己的扩增范围，不是万能的。
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distant616
8楼2012-07-16 10:57:37
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yanqindeng

金虫 (正式写手)
★
bestlike: 金币+1, 鼓励新虫！ 2012-07-17 15:08:07
引用回帖:
9楼: Originally posted by distant616 at 2012-07-16 18:24:35
扩增时间肯定在，我觉得是基因浓度太低了，我想知道能够怎么样提高基因浓度呢？...

那就是把样品模板浓度增加。我以前试过把PCR产物放在高温环境（50-60度）下一段时间（根据样品体积来掌握）后在再回收。需要注意不要烘干了。
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distant616
10楼2012-07-17 14:58:55
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