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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助小鼠T-bet基因表达载体构建问题
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huazhiyun

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助小鼠T-bet基因表达载体构建问题

我想通过转染T-bet基因表达质粒诱导IFN-γ表达，但小鼠的T-bet基因CDS序列总是扩不出来，具体方法是提取小鼠脾细胞总RNA，随机引物反转，以cDNA为模板用T-bet的引物扩增，准备连接pCDNA3.1+载体。扩了许多次测序结果都不正确，文献中有说需要一些刺激物增加T-bet表达，但我只需要T-bet序列，买这些刺激物太浪费了，有哪位大神曾经扩出来过，请教具体方法，或者有已经构建好的表达质粒那再好不过。
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每天进步一点点~
1楼 2013-03-05 09:33:17
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gyesang

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 建议楼主提取小鼠脾细胞总RNA后，用Oligo dT作为逆转录引物试试

2. 正如你所考虑到的，T-bet基因在小鼠脾细胞中的表达丰度可能比较低，你可以提取多个器官的RNA，逆转录成cDNA，然后将这些cDNA混合作为你PCR模板，来消除T-bet在某些器官表达丰度低的问题
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2楼2013-03-05 18:30:36
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huazhiyun

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-03-05 18:30:36
1. 建议楼主提取小鼠脾细胞总RNA后，用Oligo dT作为逆转录引物试试

2. 正如你所考虑到的，T-bet基因在小鼠脾细胞中的表达丰度可能比较低，你可以提取多个器官的RNA，逆转录成cDNA，然后将这些cDNA混合作为你PCR模 ...

多谢指教~
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每天进步一点点~
3楼2013-03-06 09:11:32
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