应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » rt-qpcr标准曲线问题
51/1返回列表
查看: 3218  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

gaoyu_1984

金虫 (小有名气)

[求助] rt-qpcr标准曲线问题

大家好，最近在做rt-qpcr，用了很久的标曲RNA样品(最高浓度约为90ng/uL，稀释5个梯度)，两周之前一切正常，慢慢就开始最低那个浓度梯度不能扩增，后来迅速发展为倒数第二个也不能扩增。标曲只剩下了3个点。以为是RNA降解了，于是重新制作了标样，浓度约为300ng/uL，可最低两个浓度还是不能正确有效扩增，前面三个浓度CT分别约为（18.75，20.74, 24.54）
于是又考虑probe,primer，RNase free water污染等原因，重新取了primer和probe stock（开封半年，-30度保存），还是一样。然后又用了新kit，全部使用了带滤膜的枪头，可还是一样。
kit: platimum quantitative rt-pcr thermoscript one-step system (invitrogen)
还请明白人指点一下那里可能出了问题。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-01-28 13:21:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by gaoyu_1984 at 2013-01-29 08:27:35
谢谢！由于之前的实验一直没问题，且为了排除RNA降解的原因，重新提取了RNA做标曲，可还是一样，所以有点不明白。昨晚的结果发现增加probe的量，最低两个浓度出现扩增，可还不是正确扩增，今天准备再试试。...

嗯，增加探针的量，如果你发现不是正确扩增，可适当提高退火温度
赞一下 回复此楼
生物化学与分子生物学
7楼2013-01-29 08:45:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-28 19:58:10
我个人不太理解楼主的实验，我说下我个人做这方面实验的过程，希望有参考价值。
1. 采用绝对定量的方法的时候，做标曲所采用的是标准品质粒，10倍浓度稀释
2. 相对定量的时候做标曲所采用的标准品是反转录而成的cDNA，也是同样稀释。
楼主所采用的RNA来做标曲，理论上也是可以的，但操作不好的话可能真的会讲解。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

gaoyu_1984
风雪夜归人
2楼2013-01-28 16:40:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
rna浓度越低越容易降解，这是一方面
另一方面认真回忆回忆你的实验操作步骤，和第一次成功的那次比对下
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

gaoyu_1984
生物化学与分子生物学
3楼2013-01-28 17:33:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gaoyu_1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wqj1988926 at 2013-01-28 16:40:23
我个人不太理解楼主的实验，我说下我个人做这方面实验的过程，希望有参考价值。
1. 采用绝对定量的方法的时候，做标曲所采用的是标准品质粒，10倍浓度稀释
2. 相对定量的时候做标曲所采用的标准品是反转录而成的c ...

谢谢回复。没说清楚，不好意思。我做的是相对定量，目前是参比基因B-actin的标曲出现了上述问题。因为我使用的试剂盒是可以同时实现反转录和PCR扩增的，所以标样一直用的都是RNA。只是最近出了问题，又找不到原因。
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-29 08:22:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭