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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » rt-qpcr标准曲线问题
汕头大学海洋科学接受调剂
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gaoyu_1984

金虫 (小有名气)

[求助] rt-qpcr标准曲线问题

大家好，最近在做rt-qpcr，用了很久的标曲RNA样品(最高浓度约为90ng/uL，稀释5个梯度)，两周之前一切正常，慢慢就开始最低那个浓度梯度不能扩增，后来迅速发展为倒数第二个也不能扩增。标曲只剩下了3个点。以为是RNA降解了，于是重新制作了标样，浓度约为300ng/uL，可最低两个浓度还是不能正确有效扩增，前面三个浓度CT分别约为（18.75，20.74, 24.54）
于是又考虑probe,primer，RNase free water污染等原因，重新取了primer和probe stock（开封半年，-30度保存），还是一样。然后又用了新kit，全部使用了带滤膜的枪头，可还是一样。
kit: platimum quantitative rt-pcr thermoscript one-step system (invitrogen)
还请明白人指点一下那里可能出了问题。
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1楼 2013-01-28 13:21:47
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-28 19:58:10
我个人不太理解楼主的实验，我说下我个人做这方面实验的过程，希望有参考价值。
1. 采用绝对定量的方法的时候，做标曲所采用的是标准品质粒，10倍浓度稀释
2. 相对定量的时候做标曲所采用的标准品是反转录而成的cDNA，也是同样稀释。
楼主所采用的RNA来做标曲，理论上也是可以的，但操作不好的话可能真的会讲解。
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gaoyu_1984
风雪夜归人
2楼2013-01-28 16:40:23
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
rna浓度越低越容易降解，这是一方面
另一方面认真回忆回忆你的实验操作步骤，和第一次成功的那次比对下
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

gaoyu_1984
生物化学与分子生物学
3楼2013-01-28 17:33:58
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gaoyu_1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wqj1988926 at 2013-01-28 16:40:23
我个人不太理解楼主的实验，我说下我个人做这方面实验的过程，希望有参考价值。
1. 采用绝对定量的方法的时候，做标曲所采用的是标准品质粒，10倍浓度稀释
2. 相对定量的时候做标曲所采用的标准品是反转录而成的c ...

谢谢回复。没说清楚，不好意思。我做的是相对定量，目前是参比基因B-actin的标曲出现了上述问题。因为我使用的试剂盒是可以同时实现反转录和PCR扩增的，所以标样一直用的都是RNA。只是最近出了问题，又找不到原因。
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4楼2013-01-29 08:22:48
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gaoyu_1984

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by lidonghong at 2013-01-28 17:33:58
rna浓度越低越容易降解，这是一方面
另一方面认真回忆回忆你的实验操作步骤，和第一次成功的那次比对下

谢谢！由于之前的实验一直没问题，且为了排除RNA降解的原因，重新提取了RNA做标曲，可还是一样，所以有点不明白。昨晚的结果发现增加probe的量，最低两个浓度出现扩增，可还不是正确扩增，今天准备再试试。
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5楼2013-01-29 08:27:35
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gaoyu_1984

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wqj1988926 at 2013-01-28 16:40:23
我个人不太理解楼主的实验，我说下我个人做这方面实验的过程，希望有参考价值。
1. 采用绝对定量的方法的时候，做标曲所采用的是标准品质粒，10倍浓度稀释
2. 相对定量的时候做标曲所采用的标准品是反转录而成的c ...

谢谢回复！有什么想法的话还请指点~~
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6楼2013-01-29 08:30:24
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by gaoyu_1984 at 2013-01-29 08:27:35
谢谢！由于之前的实验一直没问题，且为了排除RNA降解的原因，重新提取了RNA做标曲，可还是一样，所以有点不明白。昨晚的结果发现增加probe的量，最低两个浓度出现扩增，可还不是正确扩增，今天准备再试试。...

嗯，增加探针的量，如果你发现不是正确扩增，可适当提高退火温度
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生物化学与分子生物学
7楼2013-01-29 08:45:07
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wqj1988926

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gaoyu_1984 at 2013-01-29 08:30:24
谢谢回复！有什么想法的话还请指点~~...

知无不言，言无不尽。谢谢楼主的鲜花。
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风雪夜归人
8楼2013-01-29 10:14:05
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

楼主的RNA 稀释的浓度会不会太低了，按照你的说法第一次做的时候最高的浓度是90,我不太清楚楼主的试剂盒的性能，在这个浓度之下还可以保证反转录效率。还有就是楼主再确定一下引物是否合适，体系的合理性。总之，分子生物学的实验有时候就是这样的，会有莫名其妙的问题出现，我们能做的只有尽量注意各个方面。
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风雪夜归人
9楼2013-01-29 11:05:45
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gaoyu_1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wqj1988926 at 2013-01-29 11:05:45
楼主的RNA 稀释的浓度会不会太低了，按照你的说法第一次做的时候最高的浓度是90,我不太清楚楼主的试剂盒的性能，在这个浓度之下还可以保证反转录效率。还有就是楼主再确定一下引物是否合适，体系的合理性。总之，分 ...

试剂盒要求总RNA模板量只要在1pg-1ug范围内就可以，我计算过，我的最低浓度是22.5pg，按说是符合的。尝试了增加probe量，结果还是不能实现正确扩增。下次我准备提高RNA浓度再试试。谢谢你。
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10楼2013-01-29 14:12:31
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