应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » rt-qpcr标准曲线问题
汕头大学海洋科学接受调剂
51/1返回列表
查看: 3422  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

gaoyu_1984

金虫 (小有名气)

[求助] rt-qpcr标准曲线问题

大家好，最近在做rt-qpcr，用了很久的标曲RNA样品(最高浓度约为90ng/uL，稀释5个梯度)，两周之前一切正常，慢慢就开始最低那个浓度梯度不能扩增，后来迅速发展为倒数第二个也不能扩增。标曲只剩下了3个点。以为是RNA降解了，于是重新制作了标样，浓度约为300ng/uL，可最低两个浓度还是不能正确有效扩增，前面三个浓度CT分别约为（18.75，20.74, 24.54）
于是又考虑probe,primer，RNase free water污染等原因，重新取了primer和probe stock（开封半年，-30度保存），还是一样。然后又用了新kit，全部使用了带滤膜的枪头，可还是一样。
kit: platimum quantitative rt-pcr thermoscript one-step system (invitrogen)
还请明白人指点一下那里可能出了问题。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-01-28 13:21:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gaoyu_1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wqj1988926 at 2013-01-29 11:05:45
楼主的RNA 稀释的浓度会不会太低了，按照你的说法第一次做的时候最高的浓度是90,我不太清楚楼主的试剂盒的性能，在这个浓度之下还可以保证反转录效率。还有就是楼主再确定一下引物是否合适，体系的合理性。总之，分 ...

试剂盒要求总RNA模板量只要在1pg-1ug范围内就可以，我计算过，我的最低浓度是22.5pg，按说是符合的。尝试了增加probe量，结果还是不能实现正确扩增。下次我准备提高RNA浓度再试试。谢谢你。
赞一下 回复此楼
10楼2013-01-29 14:12:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-28 19:58:10
我个人不太理解楼主的实验，我说下我个人做这方面实验的过程，希望有参考价值。
1. 采用绝对定量的方法的时候，做标曲所采用的是标准品质粒，10倍浓度稀释
2. 相对定量的时候做标曲所采用的标准品是反转录而成的cDNA，也是同样稀释。
楼主所采用的RNA来做标曲，理论上也是可以的，但操作不好的话可能真的会讲解。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

gaoyu_1984
风雪夜归人
2楼2013-01-28 16:40:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
rna浓度越低越容易降解，这是一方面
另一方面认真回忆回忆你的实验操作步骤，和第一次成功的那次比对下
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

gaoyu_1984
生物化学与分子生物学
3楼2013-01-28 17:33:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gaoyu_1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wqj1988926 at 2013-01-28 16:40:23
我个人不太理解楼主的实验，我说下我个人做这方面实验的过程，希望有参考价值。
1. 采用绝对定量的方法的时候，做标曲所采用的是标准品质粒，10倍浓度稀释
2. 相对定量的时候做标曲所采用的标准品是反转录而成的c ...

谢谢回复。没说清楚，不好意思。我做的是相对定量，目前是参比基因B-actin的标曲出现了上述问题。因为我使用的试剂盒是可以同时实现反转录和PCR扩增的，所以标样一直用的都是RNA。只是最近出了问题，又找不到原因。
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-29 08:22:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 人工智能320调剂08工类还有机会吗 +16 振—TZ 2026-04-10 17/850 2026-04-14 00:50 by 王珺璞
[考研] 085801电气专硕272求调剂 +12 电气李 2026-04-13 13/650 2026-04-13 21:12 by gretl
[考研] 297工科，求调剂? +13 河南农业大学-能 2026-04-12 13/650 2026-04-13 14:12 by dingyanbo1
[考研] 085408光电信息工程专硕355一志愿长春光机所调剂 +3 王ymaa 2026-04-13 3/150 2026-04-13 11:01 by zhshch
[考研] 0831生医工第一轮调剂失败求助 +12 小熊睿睿_s 2026-04-11 16/800 2026-04-12 16:28 by 钰璞
[基金申请] 山东省基金2026 +5 jerry681 2026-04-08 6/300 2026-04-12 08:33 by kudofaye
[考研] 331求调剂 +5 王国帅 2026-04-11 5/250 2026-04-11 22:56 by 溪涧流水
[考研] 343求调剂 +9 王国帅 2026-04-10 9/450 2026-04-11 20:31 by dongdian1
[考研] 0854调剂 +5 音像店听花鼓戏 2026-04-10 5/250 2026-04-11 10:49 by qingpingzhu
[考研] 087100初试311求调剂 +4 任雅琴 2026-04-09 4/200 2026-04-11 10:33 by zhq0425
[考研] 一志愿211，化学310分，本科重点双非，求调剂 +23 努力奋斗112 2026-04-08 23/1150 2026-04-10 23:29 by 314126402
[考研] 368求调剂 +3 17385968172 2026-04-10 3/150 2026-04-10 20:12 by 电子奥德彪
[考研] 中科院总分315求调剂 +8 lallalh 2026-04-09 8/400 2026-04-10 19:30 by dick_runner
[考研] 266求调剂 +29 阳阳哇塞 2026-04-07 29/1450 2026-04-10 16:20 by 高维春
[考研] 机械还有还有名额吗？太难了 +6 笑笑袁 2026-04-10 6/300 2026-04-10 11:54 by 高维春
[考研] 一志愿中南大学物理学，英一66，求调剂 +4 长烟旖旎 2026-04-08 5/250 2026-04-10 10:31 by 颖果儿
[考研] 考研调剂-材料类-284 +28 想换手机不想解� 2026-04-08 28/1400 2026-04-09 20:08 by 倒数321?
[考研] 086004 求调剂 309 +7 Yin DY 2026-04-08 7/350 2026-04-09 13:59 by Delta2012
[考研] 求调剂 +3 猪肉墩粉条cc 2026-04-08 4/200 2026-04-09 10:05 by 猪肉墩粉条cc
[考研] 313求调剂 +3 十六拾陆 2026-04-07 3/150 2026-04-07 23:20 by lbsjt
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭