应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » rt-qpcr标准曲线问题
汕头大学海洋科学接受调剂
51/1返回列表
查看: 3421  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

gaoyu_1984

金虫 (小有名气)

[求助] rt-qpcr标准曲线问题

大家好，最近在做rt-qpcr，用了很久的标曲RNA样品(最高浓度约为90ng/uL，稀释5个梯度)，两周之前一切正常，慢慢就开始最低那个浓度梯度不能扩增，后来迅速发展为倒数第二个也不能扩增。标曲只剩下了3个点。以为是RNA降解了，于是重新制作了标样，浓度约为300ng/uL，可最低两个浓度还是不能正确有效扩增，前面三个浓度CT分别约为（18.75，20.74, 24.54）
于是又考虑probe,primer，RNase free water污染等原因，重新取了primer和probe stock（开封半年，-30度保存），还是一样。然后又用了新kit，全部使用了带滤膜的枪头，可还是一样。
kit: platimum quantitative rt-pcr thermoscript one-step system (invitrogen)
还请明白人指点一下那里可能出了问题。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-01-28 13:21:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
rna浓度越低越容易降解，这是一方面
另一方面认真回忆回忆你的实验操作步骤，和第一次成功的那次比对下
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

gaoyu_1984
生物化学与分子生物学
3楼2013-01-28 17:33:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-28 19:58:10
我个人不太理解楼主的实验，我说下我个人做这方面实验的过程，希望有参考价值。
1. 采用绝对定量的方法的时候，做标曲所采用的是标准品质粒，10倍浓度稀释
2. 相对定量的时候做标曲所采用的标准品是反转录而成的cDNA，也是同样稀释。
楼主所采用的RNA来做标曲，理论上也是可以的，但操作不好的话可能真的会讲解。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

gaoyu_1984
风雪夜归人
2楼2013-01-28 16:40:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gaoyu_1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wqj1988926 at 2013-01-28 16:40:23
我个人不太理解楼主的实验，我说下我个人做这方面实验的过程，希望有参考价值。
1. 采用绝对定量的方法的时候，做标曲所采用的是标准品质粒，10倍浓度稀释
2. 相对定量的时候做标曲所采用的标准品是反转录而成的c ...

谢谢回复。没说清楚，不好意思。我做的是相对定量，目前是参比基因B-actin的标曲出现了上述问题。因为我使用的试剂盒是可以同时实现反转录和PCR扩增的，所以标样一直用的都是RNA。只是最近出了问题，又找不到原因。
赞一下 回复此楼
4楼2013-01-29 08:22:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gaoyu_1984

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by lidonghong at 2013-01-28 17:33:58
rna浓度越低越容易降解，这是一方面
另一方面认真回忆回忆你的实验操作步骤，和第一次成功的那次比对下

谢谢！由于之前的实验一直没问题，且为了排除RNA降解的原因，重新提取了RNA做标曲，可还是一样，所以有点不明白。昨晚的结果发现增加probe的量，最低两个浓度出现扩增，可还不是正确扩增，今天准备再试试。
赞一下 回复此楼
5楼2013-01-29 08:27:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂学校 +3 不会吃肉 2026-04-13 3/150 2026-04-13 23:13 by 木鱼.
[考研] 一志愿哈工大 085600 277 12材科基求调剂 5+5 chenny174 2026-04-10 36/1800 2026-04-13 22:17 by zhq0425
[考研] 085801电气专硕272求调剂 +12 电气李 2026-04-13 13/650 2026-04-13 21:12 by gretl
[考研] 279学硕食品专业求调剂院校 20+6 孤独的狼爱吃羊 2026-04-12 23/1150 2026-04-13 20:42 by biomen
[考研] 266调剂 +10 daya sun 2026-04-07 11/550 2026-04-13 10:12 by fenglj492
[考研] 366求调剂 +9 不知名的小卅 2026-04-11 9/450 2026-04-13 01:19 by 幸免 ..
[考研] 322求调剂 +6 123安康 2026-04-12 13/650 2026-04-12 15:51 by 123安康
[考研] 求调剂 +16 张番茄不炒蛋 2026-04-10 17/850 2026-04-12 13:58 by 熬夜成！
[考研] 11408。358求调剂 +3 TMYzds 2026-04-07 3/150 2026-04-11 17:10 by 氮气气气
[考研] 085410 273分调剂 +4 X1999 2026-04-09 4/200 2026-04-11 13:05 by pies112
[考研] 296求调剂 +6 汪！？！ 2026-04-09 6/300 2026-04-11 11:25 by zhq0425
[考研] 282，求调剂 +12 jggshjkkm 2026-04-09 14/700 2026-04-11 09:39 by 猪会飞
[考研] 342电子信息专硕求调剂 +9 你让我怎么荔枝 2026-04-10 10/500 2026-04-11 08:33 by zhq0425
[考研] 调剂 +12 卷卷卷心菜_ 2026-04-09 13/650 2026-04-10 22:36 by Ftglcn90
[考研] 材料专业344求调剂 +16 hualkop 2026-04-10 21/1050 2026-04-10 17:28 by laoshidan
[考研] 282，电气工程专业，求调剂，不挑专业 +9 jggshjkkm 2026-04-10 9/450 2026-04-10 14:55 by 逆水乘风
[考研] 283电子信息求调剂 +4 三石WL 2026-04-08 4/200 2026-04-09 10:21 by wp06
[考研] 313求调剂 +3 十六拾陆 2026-04-07 3/150 2026-04-07 23:20 by lbsjt
[考研] 316求调剂 +4 15318418673 2026-04-07 4/200 2026-04-07 22:12 by hemengdong
[考研] 材料调剂 +11 一样YWY 2026-04-07 11/550 2026-04-07 15:13 by shdgaomin
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭