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rt-qpcr标准曲线问题
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大家好，最近在做rt-qpcr，用了很久的标曲RNA样品(最高浓度约为90ng/uL，稀释5个梯度)，两周之前一切正常，慢慢就开始最低那个浓度梯度不能扩增，后来迅速发展为倒数第二个也不能扩增。标曲只剩下了3个点。以为是RNA降解了，于是重新制作了标样，浓度约为300ng/uL，可最低两个浓度还是不能正确有效扩增，前面三个浓度CT分别约为（18.75，20.74, 24.54） 于是又考虑probe,primer，RNase free water污染等原因，重新取了primer和probe stock（开封半年，-30度保存），还是一样。然后又用了新kit，全部使用了带滤膜的枪头，可还是一样。 kit: platimum quantitative rt-pcr thermoscript one-step system (invitrogen) 还请明白人指点一下那里可能出了问题。 |
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wqj1988926
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8楼2013-01-29 10:14:05
wqj1988926
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【答案】应助回帖
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我个人不太理解楼主的实验，我说下我个人做这方面实验的过程，希望有参考价值。 1. 采用绝对定量的方法的时候，做标曲所采用的是标准品质粒，10倍浓度稀释 2. 相对定量的时候做标曲所采用的标准品是反转录而成的cDNA，也是同样稀释。 楼主所采用的RNA来做标曲，理论上也是可以的，但操作不好的话可能真的会讲解。 |
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gaoyu_19842楼2013-01-28 16:40:23
lidonghong
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【答案】应助回帖
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rna浓度越低越容易降解，这是一方面 另一方面认真回忆回忆你的实验操作步骤，和第一次成功的那次比对下 |
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3楼2013-01-28 17:33:58
4楼2013-01-29 08:22:48
