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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)

[求助] 实时荧光定量 相同基因不同处理条件下的相对定量

第一次接触，自己也看了很多资料，依然有点糊涂，希望各位能人予以指点啊~在此先谢过了！
目的：看一个基因在胁迫条件下表达量的变化。
实验样本：一株植物胁迫0,1,2,3,4,5,6h后取材
已选定目的基因和内参基因，Tm值和产物长度类似
疑问：1、在确定目的基因和内参基因扩增效率是否一致时，每个时期的样本均需要做，还是只选择一个时期的做就可以？
2、在设置稀释梯度时，同一梯度的样本副本，是采用同一时期不同花朵所提RNA，还是同一花朵所提RNA的分装？
3、扩增效率是不是来筛选最佳的反应条件的，只要是筛选到合适的，正式试验的时候就不需要稀释成各个梯度来做，直接以各个处理时期的样本来扩增内参、目的基因就可以了~？
谢谢~
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1楼 2013-01-10 11:27:02
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 做一次就行。
2. 同一花朵，这个属于标准品，当然要固定一个样本啦。
3. 对，稀释梯度是为了做标准曲线，为了看扩增效率的，如果效率接近，每次就用相对定量就好了，不用做标准曲线了。
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2楼2013-01-10 13:41:55
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
2楼说的对，如果扩增效率在5% 的误差范围内，我建议用相对定量，这个比较简单，不然你做决定定量的话，每次做样品的同时都要做标准曲线
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
3楼2013-01-10 13:51:12
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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by txw87 at 2013-01-10 13:41:55
1. 做一次就行。
2. 同一花朵，这个属于标准品，当然要固定一个样本啦。
3. 对，稀释梯度是为了做标准曲线，为了看扩增效率的，如果效率接近，每次就用相对定量就好了，不用做标准曲线了。

太感谢了！回答得清晰明了~瞬间明白了！太感谢了~
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4楼2013-01-11 12:53:24
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桃之夭夭pFly

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 475502411 at 2013-01-10 13:51:12
2楼说的对，如果扩增效率在5% 的误差范围内，我建议用相对定量，这个比较简单，不然你做决定定量的话，每次做样品的同时都要做标准曲线

好的~感谢感谢`
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5楼2013-01-11 13:03:32
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