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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于蛋白质银染的问题请教
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于蛋白质银染的问题请教

最近做了银染 结果不好 有没有懂的朋友帮忙看下 怎么改进 让结果更清楚

下面是染色结果：发现最后显色的时候 上部分高分子量蛋白质很密集 一下子条带就很深 下面小分子很浅 等下面部分小分子量条带出来了以后吧 上面颜色深的看不见了   不知道怎么改进

左边两个条带是marker，接着两个是银染的marker（条带不知道为什么没有显示出来），接着是样品，胶用的10%，用的pierce的银染kit。

懂的朋友希望给一些改进意见。
DSC_0468.jpg(1.81MB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DdoOiRTuUAQA7fb?p=130497
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1楼2013-01-10 09:09:39
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zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-01-10 20:29:01
感觉是你的玻璃板上端没有洗干净引起。条带的原因是不可避免的，小分子的敏感性是要差些。不懂你银染的marker的意思，是不是量的问题？如果有人说用于银染maker，他的量应该是很少，（主要是你做银染也是为了显示微量物质，对吧？）如果我猜的有道理，那就是你上样用量多了。
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shine
2楼2013-01-10 10:43:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-01-10 20:29:04
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流！ 2013-01-10 20:29:16
pumpkin236: 金币+2 2013-01-11 01:19:06
感觉你的样品没有制好似的。泳道内有纵向拖尾。洗玻璃板时最后要用mili-q润洗。不知道你做的什么样品，是否在小分子量区的蛋白比较少。一般的样品也有这种趋势，蛋白在一定分子量区会比较密集。如果想让胶上下均匀一点，可以做梯度胶试试。此外，银染很灵敏，不知道你的上样量是多少ug蛋白，跑的是多大的胶。没有用kit银染过，不知道是不是kit的问题。说实话啊，我不喜欢pierce的东西。
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3楼2013-01-10 11:18:23
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-10 11:18:23
感觉你的样品没有制好似的。泳道内有纵向拖尾。洗玻璃板时最后要用mili-q润洗。不知道你做的什么样品，是否在小分子量区的蛋白比较少。一般的样品也有这种趋势，蛋白在一定分子量区会比较密集。如果想让胶上下均匀一 ...

胶用的是10%的nupage bis－tris的胶，上样总的是3ug。不知道怎么解决纵向拖尾现象呢？
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4楼2013-01-11 01:18:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by pumpkin236 at 2013-01-11 01:18:30
胶用的是10%的nupage bis－tris的胶，上样总的是3ug。不知道怎么解决纵向拖尾现象呢？...

上样是3ug蛋白在mini gel吗？应该不算多。你上样前是否对样品离心？感觉是样品变性不好或者有大的颗粒。
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5楼2013-01-11 08:30:05
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pumpkin236

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-11 08:30:05
上样是3ug蛋白在mini gel吗？应该不算多。你上样前是否对样品离心？感觉是样品变性不好或者有大的颗粒。...

我又用这个样品重复了一次，纵向拖尾特别严重，w也感觉样品处理的不好。你能告诉我详细的样品处理的方法么？

我先说下 平时怎么处理的：
1 离心收集细胞（收集前会用pbs洗一次）
2 加裂解夜（sigma），我是纤维细胞，所以10cm 皿的细胞我一般只加50-80ul的裂解夜，怕加多了蛋白浓度低，但是每次浓度也只有1-2ug／ul。裂解15min，然后13000g 15min 离心
3 收集上清，上清中加入上样缓冲液和2-巯基乙醇。比列是65%：25%：10%
4 90 度 5min

我需要加上样buffer的时候再加1%sds否，我感觉样品没溶解好
谢谢
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6楼2013-01-12 00:56:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by pumpkin236 at 2013-01-12 00:56:09
我又用这个样品重复了一次，纵向拖尾特别严重，w也感觉样品处理的不好。你能告诉我详细的样品处理的方法么？

我先说下 平时怎么处理的：
1 离心收集细胞（收集前会用pbs洗一次）
2 加裂解夜（sigma），我是纤 ...

我是把巯基乙醇加在上样buffer里的，加1/10，上样buffer本身含有4%的SDS，样品和上样buffer(含巯基乙醇)是按照1:1加的，也就是最终SDS的浓度是2%。巯基乙醇是5%。不知道你的上样buffer里的SDS含量多少，我觉得SDS的终浓度不小于1%就可以把样品变性完全。
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7楼2013-01-12 06:34:53
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