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黑色月光

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助】{蛋白质测定相关问题 已有9人参与

我现在在做酶解虾壳粉提取蛋白的实验,其酶解液将作为风味料反应的基液。
我先前一直用凯氏定氮法测定酶解液中蛋白含量,但结果发现加入酶和没加入酶的含氮量基本相同,我已排除加酶量、酶解时间以及所加入的酶的问题,这到底是怎么回事呢?是不是测定方法本身的问题?求高手解释,谢谢!
PS:也有师姐跟我说会不会是我的虾壳粉(虾头、虾壳、虾脚粉碎而成)因为前处理是低温(50~60度)烘干的,虾本身含有的酶没有被灭活的缘故。可是一个老师跟我说,烘5~6小时这么长时间,酶早就灭活了。



把昨天的补充一下:
今天,我让师姐用福林酚法测了一下,之前我做的处理是:5g虾粉:100ml缓冲液,分三组,第一组不加酶;第二组加复合蛋白酶,第三组加风味蛋白酶。蛋白酶添加量均为原料重量的0.2%,50度水解3小时,100度灭酶10min,离心取上清,均定容至100ml。师姐用我的料液稀释30倍后测得的吸光度是:第一组 0.513;第二组 0.525; 第三组 0.544       师姐说后面两个值与她之前做的差不多,但没有加酶的第一组数值却比她做过的高很多。她所用的虾粉前处理用过105度烘干,我的只是低温烘干,这么看来难道是我的原料前处理的关系吗?

[ Last edited by 黑色月光 on 2010-7-15 at 23:02 ]
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柳飞绵

木虫 (著名写手)


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灭活不灭活应该不影响凯氏定氮法的结果啊。我感觉可能酶加的太少了,方法存在误差,100g加0.2g酶,蛋白质含量才44.2左右,何况你才取了5g,才2.21g蛋白,其中酶的含量才0.01g。凯氏定氮法好像没有这个精度啊
饮半盏当知江河滋味,拾一叶尽显人间秋凉
7楼2010-07-16 08:57:48
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普通回帖

柳飞绵

木虫 (著名写手)


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你加了多少酶阿?
饮半盏当知江河滋味,拾一叶尽显人间秋凉
2楼2010-07-15 09:10:11
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羡慕双眼皮

禁虫 (小有名气)


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3楼2010-07-15 11:25:12
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201103yxw

木虫 (正式写手)


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虾壳蛋白含量多少啊?你是怎么排除酶解时间这个因素的?
学习,好学习,好好学习
4楼2010-07-15 17:35:55
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黑色月光

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 柳飞绵 at 2010-07-15 09:10:11:
你加了多少酶阿?

0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的都试过。。。
5楼2010-07-15 22:40:18
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黑色月光

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 201103yxw at 2010-07-15 17:35:55:
虾壳蛋白含量多少啊?你是怎么排除酶解时间这个因素的?

1小时、2小时、3小时酶解的结果与未添加酶的都一样。。。
原料蛋白含量:44%左右
6楼2010-07-15 22:48:33
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201103yxw

木虫 (正式写手)


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时间应该没有什么问题 ,但是你的添加酶的量是不是有点少,微量凯氏定氮法的适用范围是0.2-1.0mg/ml氮,你看看处理后样品是否在此范围
学习,好学习,好好学习
8楼2010-07-16 13:12:39
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黑色月光

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 柳飞绵 at 2010-07-16 08:57:48:
灭活不灭活应该不影响凯氏定氮法的结果啊。我感觉可能酶加的太少了,方法存在误差,100g加0.2g酶,蛋白质含量才44.2左右,何况你才取了5g,才2.21g蛋白,其中酶的含量才0.01g。凯氏定氮法好像没有这个精度啊

不是酶作为蛋白质对于测定结果的影响,而是我觉得虾壳粉里面本身的酶对水解的过程起了干扰作用,使得不加酶水解得到的结果偏高,与另外添加酶的结果相差不大。。。
9楼2010-07-18 04:40:21
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黑色月光

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 柳飞绵 at 2010-07-16 08:57:48:
灭活不灭活应该不影响凯氏定氮法的结果啊。我感觉可能酶加的太少了,方法存在误差,100g加0.2g酶,蛋白质含量才44.2左右,何况你才取了5g,才2.21g蛋白,其中酶的含量才0.01g。凯氏定氮法好像没有这个精度啊

今天我用福林酚法做了一下,并且把酶解过程中加的酶提高到了原料的1%,而且我把我的原料虾粉也进行了105度烘干,可是测定结果仍然不理想,试样稀释30倍后,680nm下吸光度为:未加酶的 0.586;加入复合蛋白酶的 0.593;加入风味蛋白酶的 0.590。
10楼2010-07-18 04:51:12
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