| 查看: 1041 | 回复: 2 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
真核表达his-tag蛋白纯化后没有活性
|
||
|
具体的实验总结： 1. 表达载体pHis1522，表达菌Bacillus Megaterium，中文叫巨大芽孢杆菌，木糖启动子 2. 目的蛋白A很大，300多KD，his-tag在蛋白c端 3. 成熟的protocal和paper，之前的实验室其他人提取出来过 4. 我表达后电泳跑出来了，但是没有毒性 5. 表达的时候同时做了与其同源的同构建载体的另一个蛋白B的表达，同protocal，没有问题，当然，B表达量高 6. 因为实验室不是做蛋白的实验室，没有高级的纯化系统，用的是Merck的重力柱，手动梯度洗脱。 现在很纠结的就是没活性，木糖启动子是37度诱导，paper上说的是12-16h诱导，我降温到30度，提取没活性，降温到25度，不挂柱，超声2s，停10s binding buffer 没有咪唑的 |
回复此楼» 猜你喜欢
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有4人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有4人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有5人回复
-
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有5人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急
已经有5人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有5人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有5人回复
-
售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求助！关于GST融合蛋白纯化！楼主愁得一夜没有睡好！
已经有20人回复
- His Tag融合蛋白纯化
已经有8人回复
- 原核表达蛋白变小
已经有4人回复
- 带HIS标签的可溶蛋白的纯化问题
已经有20人回复
- 关于E-tag标记蛋白的纯化问题！~求助，谢谢帮忙~！
已经有9人回复
- 蛋白激酶原核表达
已经有14人回复
- 原核表达，蛋白活性问题
已经有12人回复
- 纯化出的蛋白没有活性，求教！
已经有14人回复
- 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白
已经有16人回复
- his标签蛋白纯化，不挂柱
已经有18人回复
- 渗透冲击法 裂解诱导后的E.coli BL21(DE3)，提纯HIS-tag蛋白，求指导
已经有12人回复
- 【求助/交流】关于his-tagged 蛋白纯化
已经有9人回复
- 【求助/交流】组氨酸标记的蛋白表达活性问题
已经有17人回复
- 【求助/交流】请教一个his-tag蛋白质纯化问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】老婆实验表达的真核蛋白没有活性，无比郁闷，祈求建议和祝福
已经有42人回复
- 【求助/交流】蛋白纯化后透析及浓缩问题
已经有8人回复
- 【求助/交流】原核表达蛋白纯化
已经有29人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
3楼2012-12-25 16:18:28
reallpf
木虫 (正式写手)
- MicEPI: 21
- 应助: 150 (高中生)
- 金币: 3388.3
- 散金: 2
- 红花: 12
- 帖子: 342
- 在线: 72.6小时
- 虫号: 1892494
- 注册: 2012-07-14
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
先要确定问题出在表达还是纯化阶段：拿阳性对照，同时测纯化前后样品的活力。 如果是纯化阶段，建议测序检验His-tag是否加在基因后面了；如果成功添加His-tag，就要从纯化的方式上考虑了。 如果没有较好的纯化柱子，建议将样品超滤脱盐后测酶活。因为离子对酶活也会有影响。 如果纯化前的样品就没有活力，那么问题就比较复杂了。因为你的SDS-PAGE结果有目的蛋白，而且是在成熟protocol和paper的基础上，那么可以确定蛋白是得到表达了，而且方法没有问题。所以需要从你使用的宿主考虑了。我朋友的经历，表达一个酶，比你的结果更奇怪，总是有条带没酶活或者有较低酶活但是没有条带。 认为需要确认酶是否需要某些后加工，而使用的宿主无法提供；或者有酶原序列的问题；另外可以考虑真对你的宿主优化密码子以及培养发酵条件。 个人观点。 |
2楼2012-12-21 16:19:56
